帕金森病患者血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的檢測及臨床意義

趙雪晴， 牛 平， 蘇 岑

近年來，越來越多的證據表明免疫炎癥反應與帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發病機制密切相關。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由不同類型細胞分泌和調節的促炎性細胞因子，其對多巴胺(dopamine，DA)能神經元具有潛在的毒性作用。在慢性腺病毒表達的大鼠黑質內，TNF-α可導致時間依賴性的 DA能神經元死亡［1］。在免疫反應中，TNF-α通過與高親和力細胞表面受體TNFR1(tumor necrosis factor-αreceptor-1，TNFR1)和 TNFR2(tumor necrosis factor-α receptor-2，TNFR2)結合，發揮生物學效應。

TNFR1和TNFR2的胞外部分在TNF-α轉換酶作用下，從細胞膜脫落形成可溶性TNFR1(soluble tumor necrosis factor-α receptor-1，sTNFR1)和可溶性TNFR2(soluble tumor necrosis factor-α receptor-2，sTNFR2)至外周血循環中，形成雙反饋系統，調節TNF-α的生物學活性，因此，同時測量兩個sTNFRs水平對評估TNF-α的整體水平是必要的，被認為是比 TNF-α 更可靠的標記物［2］。

本實驗對 PD患者血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平同時進行檢測，以評估TNF-α整體水平的臨床意義，同時對PD的免疫炎癥反應機制進行更深入的探討，相關研究國內尚未見報道。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇我院2011年11月～2012年6月門診就診的原發性PD患者40例，診斷符合中華醫學會神經病學分會運動障礙學及帕金森病學組制定的診斷標準。男23例，女17例，年齡47～87歲，平均67.28±9.36 歲，病程 1 ～20年，平均 4.68±3.74年。排除感染性疾病、免疫性疾病、肝、腎功能不全及應用免疫抑制劑者。病情評估采用PD統一評分量表第3部分(The United Parkinson’s Disease Rate Scale Part III，UPDRS III)評分及改良Hoehn-Yahr分級量表，PD患者UPDRS III評分結果為7～44分，平均為16.5 ±9.74 分;改良 Hoehn-Yahr分級為1級10例，1.5級3例，2級8例，2.5級8例，3級6例，4級3例，5級1例。對照組30例，為同期健康體檢者，男17例，女13例，年齡47～81歲，平均62.07±10.42歲，兩組性別及年齡匹配。

1.2 分組 PD組按治療情況不同分為3組，未用藥組(未服用任何抗PD藥物)、單藥組(僅服用多巴制劑)、聯合用藥組(服用多巴制劑、多巴受體激動劑等2種以上藥物)。

1.3 方法 空腹、肘正中靜脈采血3ml，不抗凝，1h內離心，分離血清，分裝后保存于-80℃冰箱內。采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked Immunolsorbent Assay，ELISA)定量檢測血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2 水平 (TNF-α、sTNFR1、sTNFR2試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件包對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩獨立樣本組間比較采用t檢驗，多獨立樣本各組間差異顯著性比較采用單因素方差分析(ANOVA)，計量資料兩組間相關性檢驗采用Pearson直線相關分析，設定P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 PD 組和對照組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較 PD組及對照組血清sTNFR1水平分別為 793.55 ±192.21pg/ml、663.67 ±184.32pg/ml，PD組明顯高于對照組，差異極顯著(P＜0.01)。PD組及對照組血清 TNF-α水平分別為21.49±9.23pg/ml、19.11 ±6.96pg/ml;sTNFR2 水平分別為1757.49 ±211.34pg/ml、1698.28 ±203.13pg/ml，差異均無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 PD 組和對照組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平相關性分析PD組血清TNF-α和sTNFR1水平呈低度正相關(rs=0.40，P ＜0.05)，sTNFR1 與sTNFR2水平顯著正相關(rs=0.55，P ＜ 0.01)，TNF-α 與 sTNFR2 水平無相關性(rs=0.26，P ＞0.05)。對照組血清TNF-α與sTNFR1無相關性(rs=0.34，P ＞0.05)，sTNFR1 與 sTNFR2 水平呈中度正相關(rs=0.42，P ＜0.05)，TNF-α 與 sTNFR2 水平無相關性(rs=0.31，P ＞0.05)(見表2)。

2.3 PD 組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2 水平與年齡、病程、UPDRS III評分及改良Hoehn-Yahr分級的相關性分析 PD組血清TNF-α水平與年齡、病程、UPDRS III評分及改良Hoehn-Yahr分級進行相關性分析，結果表明均無相關性(均P＞0.05);血清sTNFR1水平與年齡呈顯著正相關(rs=0.497，P＜0.01)，與病程、UPDRS III評分及改良 Hoehn-Yahr分級均無相關性(均 P＞0.05);血清 sTNFR2水平與年齡呈低度正相關(rs=0.353，P ＜0.05)，與病程、UPDRS III評分及改良Hoehn-Yahr分級均無相關性(均 P ＞0.05)(見表3)。

2.4 不同治療 PD患者血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較PD組按不同治療情況分為3組，未用藥組12例，未服用任何抗PD藥物;單藥組20例，僅服用多巴制劑或多巴受體激動劑;聯合用藥組8例，服用多巴制劑、多巴受體激動劑等兩種以上藥物。3組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)(見表4)。

表1 PD組和對照組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較(±s)

表1 PD組和對照組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平比較(±s)

與對照組比較*P＜0.01

組別 例數 TNF-α(pg/ml) sTNFR1(pg/ml) sTNFR2(pg/ml)PD組對照組40 30 21.49 ±9.23 19.11 ±6.96 793.55 ±192.21*663.67 ±184.32 1757.49 ±211.34 1698.28 ±203.13

表2 PD組和對照組血清TNF-α、sTNFR1 sTNFR2水平相關性(rs)

表3 PD組血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平與年齡病程、UDPRS評分、改良的Hoehn-Yahr分級相關性(rs)

表4 PD組不同治療同情況血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的比較(±s)

表4 PD組不同治療同情況血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的比較(±s)

組別 例數 TNF-α(pg/ml) sTNFR1(pg/ml) sTNFR2(pg/ml)未用藥組單藥組聯合用藥組F 12 20 8 19.62 ±5.93 20.37 ±6.40 27.70 ±14.68 2.65 745.03 ±218.41 782.81 ±179.13 881.98 ±189.22 1.34 1752.25 ±210.10 1718.90 ±180.15 1845.95 ±267.65 1.12

3 討論

近年研究表明小膠質細胞介導的固有免疫反應，及T淋巴細胞介導的適應性免疫反應均參與了PD的發病機制。活化的小膠質細胞啟動中樞神經系統(CNS)固有免疫反應的同時，加劇了炎癥損傷。其分泌的細胞因子、趨化因子等使血腦屏障破壞，招募外周血淋巴細胞進入CNS，所導致的適應性免疫反應，不僅直接損傷DA能神經元，還進一步加劇了小膠質細胞活化介導的炎癥反應［3］。

持續激活的小膠質細胞釋放的促炎細胞因子是導致DA能神經元損傷的主要物質，TNF-α是其中最重要的對DA能神經元具有潛在毒性作用的細胞因子。TNF-α可促進小膠質細胞合成集落刺激因子(colony stimulating factors，CSF)，后者作為白細胞趨化因子招募血液循環中的粒細胞和巨噬細胞到達CNS的炎癥部位，參與、放大了炎癥反應，并影響細胞內鈣離子平衡，加重細胞損傷。TNF-α通過細胞表面的TNFR1和TNFR2兩種TNF受體(TNFR)，激發細胞內的信號級聯反應，影響神經元的發育，細胞的存活，突觸傳遞，離子平衡。所涉及的信號通路主要包括caspase家族介導的細胞凋亡途徑、轉錄核因子NF-κB激活的信號轉導途徑和JNK蛋白激酶的活化途徑［4］。

TNF-α在PD患者外周血及腦脊液中顯著升高的報道較多，但崔冬生等［5］報道 PD患者外周血TNF-α顯著減少。本實驗結果與以往的實驗結果不同，檢測的PD患者血清TNF-α與對照組相比無顯著性差異，這些存在爭議的結果進一步說明整體評估TNF-α水平，檢測兩個sTNFRs的水平是必要的。血循環中脫落的sTNFRs一方面可與配體TNF-α結合，限制其觸發的細胞內信號級聯反應;另一方面降低了受體數目總量，脫落后仍粘附到細胞膜上［6］。此外，sTNFRs又可被TNF-α誘導產生。本實驗結果表明PD組血清sTNFR1水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，sTNFR2水平與對照組相比無顯著性差異。提示在PD免疫炎性反應中，TNF-α主要通過細胞表面TNFR1受體激發細胞內的信號級聯反應參與DA能神經元的損傷。

本實驗結果表明PD組血清TNF-α和sTNFR1水平低度正相關(rs=0.33，P ＜0.05)，sTNFR1 和sTNFR2 水平顯著正相關(rs=0.58，P ＜0.01)，TNF-α 和 sTNFR2水平無相關性(rs=0.26，P ＞0.05)。我們推測TNF-α介導的TNFR1、TNFR2的生物學功能不是獨立的，TNFR2對TNF-α介導的TNFR1途徑有輔助作用，這一結果與 Petrus等［7］報道 TNF-α 激發TNFR1和TNFR2不同信號通路之間的交叉串擾相互影響相符。TNF-α的毒性作用可能通過TNFR1受體激活細胞凋亡途徑的關鍵酶半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)引起DA能神經元凋亡，在PD患者和MPTP或6-OHDA誘導的PD動物模型中均發現caspase-3和caspase-8的激活，支持細胞凋亡參與DA能神經元變性。不但有實驗表明TNFR的缺乏能減弱MPTP誘導的紋狀體神經毒性，而且Krishnan Sriram等［8］實驗進一步證明了TNFR缺陷的小鼠能抑制小膠質細胞活化和改變大腦區域對MPTP的易感性。TNF-α還可以通過TNFR1激活NF-κB，活化的 NF-κB調控各種基因的表達抑制細胞凋亡和促進炎癥反應。在同一PD動物模型中，TNF-α對海馬神經元有保護作用，但卻可觸發DA能神經元變性［9］。TNF-α誘導的神經毒性作用或神經保護作用可能是激活了NF-κB下游的不同信號，或特定大腦區域TNFR1和TNFR2表達差異所導致。TNFR1介導的信號通路主要功能是促炎癥和凋亡，而TNFR2是促生存的主要信號，因此完全抑制TNF-α信號不一定能產生最佳的效果，對TNFR及下游信號的更深入了解，可以促進建立新的針對TNF-α系統的療法，為許多免疫疾病帶來了可喜的前景。如新近有報道應用sTNFR2激動劑作為一個新的治療方法來治療自身免疫性脫髓鞘疾病［10］。因此，整體評估TNF-α、sTNFR1、sTNFR2之間的相互作用關系，可能為針對TNF-α途徑的PD藥物研制，開辟新思路。

我們按不同年齡、性別、病程分組進行統計學分析，結果表明PD組血清TNF-α水平與年齡、病程、UPDRS評分及Hoehn-Yahr分級分期均無相關性;血清sTNFR1、sTNFR2水平與年齡分別呈顯著正相關、低度正相關;血清sTNFR1、sTNFR2水平與病程、UPDRS評分及Hoehn-Yahr分級均無相關性。這一結果提示老化與免疫調節異常相關，可能是PD的主要危險因素。

Bessler［11］等研究報道左旋多巴可使PD患者外周血單個核細胞(PBMC)分泌TNF-α和IL-6增加。但最近，Hofmann［12］等報道在左旋多巴治療和未用藥的PD患者中血清IL-6水平沒有顯著性差異，提示應用左旋多巴治療可能影響PD患者的免疫狀態。本實驗對 PD組血清 TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平按未用藥組、單用多巴制劑組及聯合用藥組進行組間比較，結果表明各組間無顯著性差異，提示左旋多巴并沒有改變PD的免疫狀態。因此，外源性多巴制劑對外周免疫反應的影響仍有待進一步的深入研究。

［1］De Lella Ezcurra AL，Chertoff M，Ferrari C，etal.Chronic expression of low levels of tumor necrosis factor-alpha in the substantia nigra elicits progressiv neurodegeneration，delayed motor symptoms and microgliamacrophage activation［J］.Neurobiol Dis，2010，37(3):630-640.

［2］CoelhofM，Reis HJ，Nicolato，R，etal.Increased serum levels of inflammatory markers in chronicinstitutionalized patients with schizophrenia［J］.Neuroimmunomodulation，2008，15(2):140-144.

［3］Cao JJ，Li KS，Shen YQ.Activated Immune Cells in Parkinson＇s Disease［J］.JNeuroimmune Pharmacol，2011，6:323-329.

［4］McCoy MK，Tansey MG.TNF signaling inhibition in the CNS:implications for normal brain function and neurodegenerative disease［J］.J Neuroinflamm，2008，5(1):1-13.

［5］崔冬生，顧 平，耿 媛，等.帕金森病患者外周血腫瘤壞死因子水平變化［J］.河北醫藥雜志，2009，(11):1285-1286.

［6］Van Hauwermeiren F，Vandenbroucke R E，Libert C，etal.Treatment of TNF mediated diseases by selective inhibition of soluble TNF or TNFR1［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2011，22(5-6):311-319.

［7］Naude PJ，den Boer JA，Luiten PG，etal，Tumor necrosis factor receptor cross-talk［J］.FEBS J，2011，278(6):888-898.

［8］Sriram Krishnan，Matheson Joanna M，Benkovic Stanley A，etal.Deficiency of TNF receptors suppressesmicroglial activation and alters the susceptibility of brain regions to MPTP-induced neurotoxicity:role of TNF-α［J］.The FASEB J，2006，20(6):670-682.

［9］Park KM，BowersW J.Tumor necrosis factor-alphamediated signaling in neuronal homeostasis and dysfunction［J］.Cellular Signal，2010，22(7):977-983.

［10］Fisher R.A Soluble TNF Receptor 2 Agonist as a New Therapeutic Approach to Treat Autoimmune and Demyelinating Diseases［D］Stuttgart，im Februar 2011.

［11］Bessler H，Djaldetti R，Salman H，etal.IL-1β，IL-2，IL-6 and TNF-a production by peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson’s disease［J］.Biomed Pharmacother，1999，5(2):141-145.

［12］Hofmann KW，Schuh AF，Saute J，etal.Interleukin-6 serum levels in patients with Parkinson＇s disease［J］.Neurochem Res，2009，34(8):1401-1404.