分子分型時代的肺癌治療個體化趨勢

陳海泉

復旦大學附屬腫瘤醫院胸外科，復旦大學肺癌防治中心，復旦大學上海藝學院腫瘤學系，上海 200032

肺癌是世界范圍內病死率第一位的惡性腫瘤。根據《2010中國衛生統計年鑒》，我國2009年肺癌死亡率為30.83/10萬人，高居所有惡性腫瘤之首。肺癌可以分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占所有肺癌的80%。非小細胞肺癌又可以分為腺癌、鱗癌和大細胞癌。近年來肺腺癌在非小細胞肺癌中所占的比例不斷上升，已成為最常見的肺癌亞型。特別是在不吸煙的肺癌患者中，肺腺癌的比例高達70%，因為早期難以發現，且晚期治療預后極差，給社會帶來了極大的負擔。

包括腺癌在內，肺癌是一系列由多種不同分子遺傳學機制異常造成細胞分化、周期調控、衰老及凋亡等多種生物學行為失調，最終導致癌變的疾病的總和。“解碼”肺癌，特別是肺腺癌的發病機制，從分子遺傳和分子生物學層面對腫瘤自然病程的發生、發展機理進行探索是研究肺癌的基礎，也是肺癌領域科研的前沿。由于肺腺癌分子生物學機制的復雜多樣，以尋找“生物標志”為主要手段的一類轉化型研究日益凸顯出巨大的價值。該類研究通過在核酸、蛋白及微環境因子等多層面尋找腫瘤相關特異的生物標志，對具有不同易感因素、致病機制和治療敏感性的人群加以區別，從而實現高危篩查、早期診斷、個體化治療和預后判斷等。因此該領域的轉化型研究在腫瘤生物學、臨床腫瘤學、公共衛生及衛生經濟學方面都具有重要的科學、社會和經濟價值。

癌癥目前被認為是一個多基因累積突變的多步驟過程，基因突變是腫瘤產生、發展的根本原動力。基因突變包括驅動突變(driver mutation)和伴隨突變(passenger mutation)；驅動突變間相互排斥，即一種突變即可導致腫瘤的發生，成為了遺傳水平的“腫瘤生物標志”最佳選擇。目前根據已知的驅動突變的研究已經可以明確50%肺腺癌患者的突變類型、建立組織學類型下的分子亞型；并且已經直接對臨床醫學貢獻出了巨大的社會和經濟價值(一系列極具前景的靶向藥物已經FDA批準上市，如對應EGFR突變的靶向藥物厄羅替尼、吉非替尼和對應EML4-ALK融合基因的crizotinib等)；基因突變的分析為藥品研發、個體化治療展開了廣闊的藍圖。通過“分子診斷”，還可以將同一種病理類型的肺癌進一步劃分為多種“分子亞型”，并通過選擇相應的“分子靶向藥物”使患者得到更加個體化的治療。

復旦大學附屬腫瘤醫院展開了基于中國人群肺腺癌已知突變的廣泛研究，通過收集 超過腫瘤組織和配對正常肺組織，經過核酸抽提、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)直接測序、熒光原位雜交(FISH)、免疫組化、基因芯片和生物信息學分析等技術和手段對包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、ER2/ERBB2等在內的已知突變進行綜合分析，揭示了以中國人為代表的東亞肺腺癌人群，特別是不吸煙女性人群的基因突變規律，并進一步提示了突變基因作為“生物標志”在腫瘤診斷、分期以及個體化治療等方面的直接或潛在價值。

1 肺癌分子分型研究進展

1.1 中國人群肺腺癌EGFR突變的分析

一般認為，肺腺癌表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)突變東方人群高于西方、非吸煙者高于吸煙者。有研究證實EGFR突變與戒煙時間、腫瘤分期和組織學類型等相關［1］。但對于東、西方人群間非吸煙腺癌患者EGFR突變情況的比較尚無定論，特別是非吸煙的男性和女性患者間EGFR突變是否存在差異一直缺乏有力結論。復旦大學附屬腫瘤醫院對224例中國肺腺癌患者(男性114例，女性110例)進行了EGFR突變的檢測，通過總體和亞組分析發現：中國人肺腺癌樣本中EGFR突變的特征與歐美人報道的有差異，我國肺腺癌患者中不吸煙患者發生EGFR突變的比例高，并且性別差異無統計學意義(P＞0.05)［2］。進一步研究顯示：中國女性不吸煙肺腺癌患者的突變類型與年齡及腺癌病理亞型相關(圖1)［3］。

1.2 中國非吸煙人群肺腺癌已知突變的分析

在肺腺癌患者中，不吸煙的患者占有很大的比重。既往基礎和IPASS等臨床研究表明不吸煙患者的肺腺癌是一類具有特殊分子病理學特點的疾病，特別是東亞不吸煙女性對于靶向治療具有較好的反應，因此東亞不吸煙肺腺癌人群的突變水平是世界關注的焦點。因此，復旦大學附屬腫瘤醫院通過分析52例中國不吸煙肺腺癌中的常見致癌基因突變結果，提出中國不吸煙肺腺癌患者大部分都具有已知驅動突變，并且目前多數突變位點都有相應的靶向藥物治療，這為癌癥的“個體化治療”奠定了理論依據(圖2)［4］。

圖1 中國 女性不吸煙肺腺癌患者的突變類型與年齡及腺癌病理亞型的相關性分析

圖2 中國不 吸煙肺腺癌患者突變分析

1.3 非小細胞肺癌新的分子亞型—RET融合基因

復旦大學附屬腫瘤醫院準確描述并定義了非小細胞肺癌中一項新的分子亞型—RET融合基因及其獨特的臨床病理特征，同時提出了一種高效、準確的RET融合基因檢測方法［5］，解決了國際上RET融合基因檢測的難題。

復旦大學附屬腫瘤醫院對936例非小細胞肺癌進行了包括EGFR、KRAS、BRAF、HER-2、ALK和RET在內的全面的分子診斷和分型分析，發現RET融合基因存在于1.4%的非小細胞肺癌患者，并且這些患者表現出不吸煙者多見、低分化為主等一系列獨特的臨床和病理學特征；此外RET融合基因與其他已知的非小細胞肺癌分子亞型相互獨立、不重疊，進而可以將RET融合基因定義為非小細胞肺癌中的一項新的分子亞型。

該研究提出一種高效、準確、低廉的RET融合基因檢測方法：基于表達不平衡的RET融合基因檢測法。目前國際上已有數種多靶點分子靶向藥物可為具有RET融合基因的患者提供個體化治療。該研究對RET融合基因患者臨床病理特征的準確描述以及高效RET融合基因分子檢測方法的發明，將為這些藥物的后期臨床試驗的實現發揮價值。非小細胞肺癌中RET融合基因的發現令人興奮，不但增添我們對這種惡性腫瘤背后機制的深入了解，還將可能為這一類型患者提供有效的治療手段。這些分子檢測方法的進步，將使得對患者的診斷更加便捷。

1.4 ALK融合基因檢測新技術

作為肺癌分子亞型的一種，ALK融合基因存在于3%～7%的非小細胞肺癌中，以ALK融合基因為靶點的分子靶向藥物Crizotinib顯著提高了攜帶有該融合基因的肺癌患者的生存，并在2011年被美國FDA批準用于一線治療ALK融合基因陽性的晚期非小細胞肺癌患者。目前ALK融合基因檢測的主要方法包括熒光原位雜交(FISH)，以及免疫組化和逆轉錄-聚合酶鏈技術(RT-PCR)等。FISH被認為是“金標準”，但其技術復雜，整個過程至少需要2 d，檢測效率低下，并且價格不菲(約1500美元/例)。免疫組化方法敏感性較高但特異性過低，RT-PCR方法特異性較高但敏感性過低，因而都未能在臨床中大規模應用。

復旦大學附屬腫瘤醫院對ALK融合基因的檢測研究發現：ALK基因發生斷裂后激酶域表達顯著增高，而非激酶域不表達或低表達。進而發展出了“基于qPCR的ALK融合基因檢測”的新技術，即采用實時定量PCR(qPCR)的方法檢測斷裂點前后ALK 基因的表達水平，通過其水平差異實現ALK融合基因快速準確的診斷。在一項對654例非小細胞肺癌標本的分析中，使用該檢測手段檢測發現40例ALK融合基因陽性標本，經過“金標準”—FISH驗證，該技術的敏感性、特異性均達到100%(圖3)，顯著優于免疫組化、RT-PCR等其他技術［6］。除此之外，該技術還具有高通量、低成本等其他技術難以比擬的優勢：利用該技術在90 min內即可實現對48例樣本的檢測，而每例樣本的檢測成本不超過30元。

圖3 基于qPCR的ALK融合基因檢測與FISH結果完全吻合

在臨床的實際應用中，該技術可以低價、快速地得到ALK融合基因初步檢測結果，不但可以節省檢測費用，更為“惜時如金”的晚期患者診療贏得更多時間；同時，該技術所需的儀器設備極為普通、簡單，因此很易于在各級醫療科研單位中進行普及推廣；此外，該技術高通量的特點為大規模臨床試驗的患者篩選、分子流行病調查提供了極其便利的手段。

該研究被授予阿爾弗雷德·索弗研究獎(Alfred Soffer Research Award)；2012年9月1日，國際著名腫瘤學期刊《Cancer Research》將該研究譽為“突破性進展(breaking advances)”，并專門刊文進行報道。

1.5 肺腺癌EGFR突變與EGFR基因擴增的關聯

一直以來EGFR TKI靶向藥物的選擇依據除EGFR突變外還包括EGFR基因擴增和免疫組化EGFR陽性。復旦大學附屬腫瘤醫院還對我國肺腺癌患者中EGFR突變陽性者的EGFR拷貝數變化進行了研究。通過FISH或者基因芯片SNP6.0檢測肺腺癌中EGFR的拷貝數，發現EGFR的拷貝數明顯與EGFR突變相關［7］。

1.6 肺腺癌HER-2突變與HER-2/EGFR基因擴增的關聯

EGFR即HER-1，與HER-2同為驅動突變，并且在肺癌和乳腺癌中均有相應的靶向治療藥物對應；女性乳腺癌中HER-2陽性較多，而肺腺癌中EGFR陽性相對較多。作為肺腺癌的一個較少的突變亞型，復旦大學附屬腫瘤醫院在HER-2突變肺腺癌患者中分析了其突變與HER-2及EGFR基因擴增間的關聯，發現HER-2陽性的肺腺癌伴有明顯的HER-2或EGFR基因拷貝數增長，顯示兩者在發病機制間的關聯，提示未來對于肺腺癌HER-2陽性的患者進行聯合靶向治療的可能［8］。

1.7 其他肺腺癌驅動突變的研究

有研究證明LKB1通過細胞外基質重塑等機制抑制肺癌進展［9］，復旦大學附屬腫瘤醫院又進一步分析了肺腺癌中LKB1、EGFR和KRAS基因突變的特征，在國際上首次報道了中國人肺癌的LKB1突變分析結果［10］。ROS1融合基因的國際合作研究結果在世界范圍內首次證實ROS1融合基因是肺癌中一項獨立的突變亞型［11］。

上述研究在遺傳分子水平進一步揭示了肺癌的發病機制，展示了東亞人群特別是不吸煙人群肺腺癌的分子遺傳學輪廓，為針對這一大類患者的臨床研究提供了理論依據，為臨床靶向治療提供選擇依據，為尋找新的治療靶點和新的靶向藥物提供方向。

2 非小細胞肺癌患者淋巴結轉移的預測

非小細胞肺癌患者淋巴結轉移的狀況是明確患者分期的重要關鍵點，對于患者個體化治療方案的選擇及預后判斷具有重要意義。

CT上未顯示淋巴結腫大的T1期非小細胞肺癌由于N2淋巴結累及的概率相對較低，是否常規使用縱隔鏡或者PET檢查尚存在爭議。復旦大學附屬腫瘤醫院回顧性分析了530例CT診斷為T1N0的非小細胞肺癌患者接受手術切除與系統性淋巴結清掃的情況，使用單因素分析和多因素logistic回歸來評估臨床病理資料與N2淋巴結轉移的聯系。結果顯示N2淋巴結累及率為16.8%。通過logistic回歸發現了4個獨立預測N2疾病的因素：較年輕的年齡(OR＝0.974，95%CI，0.952～0.997)、較大的腫瘤直徑(OR＝2.769，95%CI：1.818～4.217)、中央型腫瘤(OR＝3.204，95%CI：1.512～6.790)以及侵襲性腺癌的組織學類型(OR＝3.537，95%CI：1.740～7.191)。這一預測模型具有較好的吻合度(Hosmer-Lemeshow檢驗：P=0.784)、較好的鑒別度(ROC曲線下面積為0.726，95%CI：0.669～0.784)以及經Bootstrapping檢驗證實的較低的“過擬合”。這一預測模型有助于預測縱隔淋巴結轉移情況，進而協助臨床決策［12］。

近年來，國內外許多 研究都致力于在原發灶直徑較小的肺癌中找到可靠的預測淋巴結N0的因素，以明確系統性淋巴結清掃的必要性。對原發灶直徑≤1 cm的患者是否需行系統性淋巴結清掃尚存在較大爭議。

復旦大學附屬腫瘤醫院回顧性分析了243例周邊型小腫塊(直徑≤2 cm)非小細胞肺癌病例中淋巴結轉移相關的因素［13］。這些小腫塊的直徑都在新鮮標本中測量(在4%的甲醛溶液固定之前)。腺癌的亞型根據2011年版的IASLC/ATS/ERS腺癌分類方法進行歸類。結果顯示N1和N2淋巴結累及率分別為5.3%和6.6%。在直徑≤1 cm的腫塊中也發現有N2淋巴結累及(2/53，3.8%)。在鱗癌、腺癌中的原位腺癌、微侵潤腺癌、貼壁亞型以及侵襲性粘液腺癌中未見淋巴結累及。以上5種組織類型占所有周圍型小直徑非小細胞肺癌的34.6%。因而通過組織學分型，在超過1/3的周圍型小直徑非小細胞肺癌中可不進行系統性淋巴結清掃。

3 展望

目前轉化研究主要針對肺腺癌患者開展，檢測范疇也僅限于目前世界上所發現的已知驅動突變。而肺腺癌總體仍有50%無法確定其驅動突變，限制了這部分患者接受個體化診治的可能。此外與肺腺癌相比，肺鱗癌的個體化治療更加是一片較難開墾的處女地，也潛藏著巨大機遇。進一步的研究將聚焦未見已知突變(pan-negative)的肺癌，探索其發病機制，提供分子生物學標志，為患者診斷與個體化治療提供依據將成為研究熱點。此外，隨著“全基因組時代”的逐漸到來，通過高通量全基因組(外顯子)測序技術探索未知的突變并進行功能的鑒定，將可能極大地推進肺癌基礎研究領域的進步，使肺癌的個體化治療更上一個臺階。

［1］ GIRARD N, SIMA C S, JACKMAN D M, et al.Nomogram to predict the presence of EGFR activating mutation in lung adenocarcinoma［J］.Eur Respir J, 2012, 39: 366-372.

［2］ SUN Y H, FANG R, GAO B, et al.Comparable rate of EGFR kinase domain mutation in lung adenocarcinomas from Chinese male and female never-smokers［J］.Acta Pharmacol Sin,2010, 31: 647-648.

［3］ ZHANG Y, SUN Y, PAN Y, et al.Frequency of driver mutations in lung adenocarcinoma from female never-smokers varies with histologic subtypes and age at diagnosis［J］.Clin Cancer Res, 2012, 18: 1947-1953.

［4］ SUN Y, REN Y, FANG Z, et al.Lung adenocarcinoma from East Asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases［J］.J Clin Oncol,2010, 28: 4616-4620.

［5］ WANG R, HU H, PAN Y, et al.RET fusions define a unique molecular and clinicopathologic subtype of non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol, 2012, 30: 4352-4359.

［6］ WANG R, PAN Y, LI C, et al.The use of quantitative realtime reverse transcriptase PCR for 5’ and 3’ portions of ALK transcripts to detect ALK rearrangements in lung cancers［J］.Clin Cancer Res, 2012, 18: 4725-4732.

［7］ LI C, SUN Y, FANG Z, et al.Comprehensive analysis of epidermal growth factor receptor gene status in lung adenocarcinoma［J］.J Thorac Oncol, 2011, 6, 1016-1021.

［8］ LI C, SUN Y, FANG R, et al.lung adenocarcinomas with HER2-activating mutations are associated with distinct clinical features and HER2/EGFR copy number gains［J］.J Thorac Oncol, 2012, 7: 85-89.

［9］ GAO Y, XIAO Q, MA H, et al.Lkb1 inhibits lung cancer progression through lysyl oxidase and extracellular matrix remodeling［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107:18892-18897.

［10］ GAO B, SUN Y, ZHANG J, et al.Spectrum of LKB1, EGFR,AND KRAS mutations in chinese lung adenocarcinomas［J］.J Thorac Oncol, 2010, 5: 1130-1135.

［11］ BERGETHON K, SHAW A T, OU S H, et al.Ros1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancer［J］.J Clin Oncol, 2012, 30: 863-870.

［12］ ZHANG Y, SUN Y, SHEN L, et al.Predictive factors of lymph node status in small peripheral non-small cell lung cancers:tumor histology is more reliable［J］.Ann Surg Oncol, 2012.［Epub ahead of print］.

［13］ ZHANG Y, SUN Y, XIANG J, et al.A prediction model for N2 disease in T1 non-small cell lung cancer［J］.J Thorac Cardiovasc Surg.2012,144:1360-1364.