不同檢測方法檢測免疫球蛋白輕鏈比值的比較

王召曉

江蘇省贛榆人民醫院，江蘇 贛榆 222100

0 前言

免疫球蛋白（immunoglobulin）主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中。人體血漿內的免疫球蛋白大多數存在于丙種球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等5類。Ig分子的基本結構由4條肽鏈組成，即由2條相同的分子量較小的輕鏈（light chain，L鏈）和2條相同的分子量較大的重鏈（heavy chain，H鏈）組成[1]。L鏈與H鏈是由二硫鍵連接形成1個四肽鏈分子，稱為Ig分子的單體，是構成免疫球蛋白分子的基本結構。

L鏈大約由214個氨基酸殘基組成，通常不含碳水化合物，分子量約為24kD。每條L鏈含有2個由鏈內二硫鍵內二硫所組成的環肽。L鏈共有兩型：kappa（κ）與lambda（λ）[2]，同一個天然免疫球蛋白分子上L鏈的型總是相同的。正常人血清中的κ：λ約為2:1。過多游離的L鏈片段在血清或尿液中大量出現稱為L鏈病（Light Chain Disease，LCD）；一旦免疫球蛋白L鏈在全身組織中沉積，引起相應的臨床表現為L鏈沉積病（Light Chain Deposition Disease，LCDD）。約2/3的LCDD患者合并多發性骨髓瘤等慢性淋巴細胞白血病。而在尿中的L鏈增多時，多表明腎臟受損嚴重。慢性腎病患者的血、尿中L鏈含量常表現出異常，但κ:λ的比值常保持在正常范圍內。臨床常通過速率散射比濁法監測血尿中L鏈含量的變化來對L鏈病進行診斷[3]。

流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一種用熒光劑對細胞特定成分染色，利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態中的單細胞或生物顆粒進行多參數、快速定量分析，并能對特定群體加以分選的現代細胞分析技術[4]。FCM能夠通過特異性表面標志物對B細胞表面表達的L鏈進行測定[3,5-11]，該方法可與速率散射比濁法一起用于臨床相關疾病的診斷，本次研究通過比較FCM法和速率散射比濁法，檢測免疫球蛋白L鏈κ/λ比值是否有一致性，進一步探討二者的臨床應用價值。

1 實驗材料

1.1 研究對象

32例患者為2009～2011年間我院已確診病人，其中12例為慢性淋巴細胞性白血病患者,男性2例,女性10例，年齡45～77歲,平均58.4歲；20例原發性腎病綜合征患者,男性12例,女性8例，年齡34～71歲,平均47.3歲。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

① 美國Beckman Coulter 公司 Immage特種蛋白儀原裝試劑：κL鏈檢測試劑盒（Lot：446440），λL鏈檢測試劑盒（Lot：446470），稀釋液、緩沖液、標準品及質控品等均為該公司提供的進口配套試劑；② 美國B-D公司FACSCalibur 流式細胞儀其原裝試劑：B-D Oncomark Anti-Kappa/Anti-Lambda/CD19 Reagents（Lot:44045）、IgG1b-FITC、IgG2a-PE、CD19-PerCP，鞘液、溶血素及質控品等均為該公司提供的進口配套試劑。

1.2.2 主要儀器

美國Beckman Coulter公司Immage特種蛋白儀和美國B-D公司FACSCalibur流式細胞儀。

2 實驗方法

2.1 實驗原理

2.1.1 FCM原理

將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的細胞緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域，流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這2種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模/數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，從而獲得所需信息。

2.1.2 速率散射比濁法原理

將可溶性抗原與相應抗體相結合，在二者比例合適時，在特殊緩沖液中，它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液出現濁度，利用激光照射液相中顆粒、檢測光折射和衍射而形成的散射光強度來定量待測物的濃度。

2.2 實驗方法

2.2.1 速率散射比濁法

血清及尿液中的κ、λL鏈的測定按美國Beckman Coulter 公司 Immage特種蛋白儀的說明書進行操作，采用速率散射比濁法來檢測L鏈κ、λ的含量，并計算κ/λ比值。

2.2.2 FCM法

用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMCs），以無菌生理鹽水洗滌3次，備用。取10μL Anti-Kappa/Anti-Lambda/CD19試劑加入流式專用試管底部,對照管為 10μL CD19-PerCP、10μL IgG2a-PE和 10μL IgG1b-FITC，每管中加入洗滌后的PBMCs 50μL,混勻后，置室溫避光反應15 min；加入1 mL溶血素,混勻，室溫避光溶血10 min，以裂解殘留的紅細胞。以1500轉/min離心5 min，棄上清液，加入生理鹽水1 mL洗滌1次，再以1500轉/min離心5min，棄去上清液。加入250μL 1%多聚甲醛，混勻后用流式細胞儀檢測。以Cell Quest軟件收集和分析數據，以CD19陽性細胞為所分析的目標細胞群，分析其中κ與λ表達狀況。κ和λ的表達率為其陽性細胞占總B淋巴細胞的百分比。并計算κ/λ比值。

2.3 統計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統計分析，結果用 ±S表示，兩組之間比較采用雙側T檢驗，檢驗水平以P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

通過對32例患者外周血B淋巴細胞膜上κ和λ表達率的測定、血清和尿液中免疫球蛋白游離L鏈Kappa和Lambda含量的測定，將所得數據進行處理。根據文獻，B淋巴細胞膜上κ/λ的參考范圍為1.03～1.59[12]，血清中L鏈κ/λ的參考范圍為1.53～3.29[13]，尿液中L鏈κ/λ的參考范圍為1.40～2.76[14]。將κ/λ值為正常的結果設為正常，低于參考范圍的結果設為異常Ⅰ，高于參考范圍的結果設為異常Ⅱ。對分組數據進行Kappa一致性檢驗，結果見表1～3。

表1 B細胞組和血清組κ/λ比值一致性的比較

表2 血清組和尿液組κ/λ比值一致性的比較

表3 B細胞組和尿液組κ/λ比值一致性的比較

3個不同組別的標本兩兩分組，分別進行檢測方法的一致性比較。結果顯示，速率散射比濁法與FCM檢測技術對于κ/λ比值，在檢測結果上一致性極強。

4 討論

免疫球蛋白由1對L鏈及1對H鏈組成，其中L鏈有κ、λ2種，每種免疫球蛋白含κL鏈或含λL鏈。骨髓B淋巴細胞在發育至前B細胞階段時出現IgL鏈基因重排，待細胞成熟后，IgL鏈可表達于細胞表面。健康人B淋巴細胞膜表面,有一部份表達κL鏈,另一部份表達λL鏈, κ/λ的參考范圍為1.31±0.28。腫瘤性B細胞來源于1個共同的B細胞株,其主要特征為IgL鏈限制性,即全部腫瘤性B細胞僅表達κL鏈或者λL鏈,也稱為克隆性表達。κ/λ比例的異常，成為反應性B淋巴細胞增生和腫瘤性慢性B淋巴細胞增生的鑒別診斷的有效指標[15-16]。

正常血清中存在一定量的多克隆L鏈，即κ、λ兩種L鏈。血清中的L鏈轉入到腎臟, 約10%在腎小管內分解代謝, 80%回收, 由體內巨噬細胞降解, 10%隨尿排出。當機體受到遺傳、環境、病毒感染、內分泌調節等多種因素刺激, 影響機體免疫應答, 致使機體免疫應答調節的關鍵基因過度表達, 可使T、B 淋巴細胞功能紊亂, 漿細胞克隆分泌增加。由于漿細胞合成的Ig的L鏈速度比H鏈速度快,組裝Ig 增多, κ、λL鏈分泌相對異常增多, 因此血清中κ、λL鏈水平也同步增加。

L鏈在腎臟從腎小球濾過,約95%濾過的L鏈在近腎小管又被重吸收,并被腎小管上皮細胞分解。當腎臟功能受損時，若尿中L鏈水平升高，在排除免疫增殖性疾病情況下，其表示腎小管受損、重吸收功能下降, 因此尿L鏈水平的測定能夠反映腎小管損傷程度。

在我們的研究中，B細胞組和血清組的比較，30例(93.75%)κ/λ的結果相同，2例(6.25%)κ/λ的結果不同，表現為比值下降。B細胞組和尿液組的比較、血清組和尿液組的比較中，均出現30例（93.75%）κ/λ的結果相同，2例(6.25%)κ/λ的結果不同，表現為比值上升。其原因可能與κL鏈分子量小，易通過腎小球慮過膜，從尿中排出的速度比λL鏈快， 所以血清中λL鏈含量相對增高、κ/λ比值下降。此結果與國內學者報告基本一致[17]。

FCM檢測采用的試劑是單克隆熒光抗體，特異性強，因此多用于鑒別B淋巴細胞是否有克隆性表達。血清和尿液中游離κ、λL鏈的測定，是漿細胞性疾病、腎臟疾病等的診斷指標之一[18]。在本實驗研究中，結果顯示2種檢測方法的結果在κ/λ比值上有極強的一致性。

在L鏈檢測中，FCM檢測技術與速率散射比濁法相比，因其更多的為手工操作，因此在實際工作中的應用不如速率散射比濁法普及。但隨著FCM的不斷發展和完善，更多高靈敏度、高特異性的標記物的發現，對于血清和尿液中κ/λ比值異常的標本，我們建議同時檢測B淋巴細胞膜上的κ/λ比值，以確定該標本是否有B淋巴細胞克隆性表達的存在。

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