環(huán)氧合酶2-1195G>A基因多態(tài)性和腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的meta分析

顧玲，高天翼，宋國(guó)齊，李瑞，許曄瓊，陳麗萍，聶珍琳，王書奎

1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210006

0 前言

腫瘤是一種與遺傳和環(huán)境有關(guān)的多因素疾病。遺傳突變會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄以及下游產(chǎn)物的表達(dá)水平，基因過(guò)表達(dá)引起基因拷貝數(shù)的增加可能會(huì)使機(jī)體易發(fā)生腫瘤[1]。因此，基因與環(huán)境的相互作用在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。人類的環(huán)氧合酶2位于1號(hào)染色體q25.2～q25.3，長(zhǎng)度約7.5 kb[2]，包含10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子。環(huán)氧合酶2作為炎癥因子，參與人體的許多病理生理過(guò)程，包括炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和血管形成[3-6]。環(huán)氧合酶2的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力及誘導(dǎo)腫瘤的免疫耐受。與此同時(shí)，越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明選擇性的環(huán)氧合酶2抑制劑可以減少腫瘤發(fā)生。目前，人們研究認(rèn)為，環(huán)氧合酶2 -1195G >A的突變導(dǎo)致啟動(dòng)子區(qū)增加了c-MYB 的結(jié)合位點(diǎn)，c-MYB與此位點(diǎn)的結(jié)合增強(qiáng)環(huán)氧合酶2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)活性[7]。近年來(lái)，諸多研究結(jié)果顯示人體許多器官的腫瘤包括淋巴癌[8-9]、結(jié)腸癌[10-15]、食道癌[6,16-19]等均發(fā)現(xiàn)伴隨-1195G > A 的突變，但研究結(jié)論卻不一致。為驗(yàn)證環(huán)氧合酶2-1195G > A與腫瘤的發(fā)生是否存在相關(guān)性，我們?cè)诖耸占煽繑?shù)據(jù)，通過(guò)meta分析求證兩者之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 搜索策略

使用Pubmed網(wǎng)站上的主題詞“環(huán)氧合酶2”“多態(tài)性”和“腫瘤”搜索相關(guān)文獻(xiàn)。搜索的限制條件為英文文獻(xiàn)，研究對(duì)象為人類。此外，通過(guò)對(duì)參考文獻(xiàn)進(jìn)行人工搜索以篩選符合條件的文章。若是不同文章研究對(duì)象相同或較小的研究樣本是較大研究的一部分，我們只選擇較大人群的研究和最新的研究。此篇研究的納入排除標(biāo)準(zhǔn)為：① 環(huán)氧合酶2-1195G > A突變與腫瘤的相關(guān)研究；② 病例對(duì)照研究；③ 可以在文獻(xiàn)中提取到有關(guān)基因型的數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)提取

所有數(shù)據(jù)由兩位工作人員分別提取、整理，并核對(duì)無(wú)誤后方可用于數(shù)據(jù)分析。對(duì)于數(shù)據(jù)中有異議的地方須雙方協(xié)調(diào)達(dá)成一致。對(duì)于每篇納入文獻(xiàn)，須提取的數(shù)據(jù)包括：第一作者、發(fā)表年限、種群、國(guó)家、病例對(duì)照組的基因頻率。對(duì)種群進(jìn)行分層分析時(shí)，我們將其分為亞洲人群、歐洲人群及混合人群，其中混合人群為病例來(lái)源一個(gè)以上的種群 [6,8-18,20-31]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算對(duì)照組中G等位基因頻率以檢驗(yàn)樣本的群體代表性。各組之間的一致性采用χ方檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為P<0.05。環(huán)氧合酶2與腫瘤之間的相關(guān)性用OR值與95%CI表示。總體研究中，我們對(duì)AA、AG基因型與野生型GG做了比較；AA合并AG基因型與GG以及AA與AG合并GG的基因型分別進(jìn)行了對(duì)比分析，此外我們還對(duì)A突變基因的顯性模型和隱形模型分別做了分析。

通過(guò)Q檢驗(yàn)分析各個(gè)文獻(xiàn)結(jié)果OR值的一致性，結(jié)果由P值決定。若P＞0.1代表各組之間一致性較好，那么OR則通過(guò)固定效應(yīng)模型求得，否則采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算[32]。此外，我們對(duì)可能存在的混雜因素進(jìn)行分層初步判斷數(shù)據(jù)異質(zhì)性的來(lái)源。OR值通過(guò)Z檢驗(yàn)確定其可信度。通過(guò)漏斗圖和Egger,s檢驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)是否存在發(fā)表偏移[33]。最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行敏感性分析以確定結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.4 主要方法

本文納入的文獻(xiàn)主要運(yùn)用以下4種測(cè)序方法：

（1） 聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRRFLP）：是用PCR儀擴(kuò)增目的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，經(jīng)過(guò)凝膠電泳，在凝膠成像與分析系統(tǒng)上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶。

（2） Taqman：Taqman熒光探針是一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增1條DNA鏈，就有1個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)定量。

（3）直接測(cè)序法：利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套4個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千個(gè)堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后，可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

（4） TDI-FP：以特異探針及熒光素標(biāo)記的ddNTP為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中循環(huán)雜交延伸后，應(yīng)用熒光偏振技術(shù)可以測(cè)量平面偏振光激發(fā)后產(chǎn)生的水平和垂直的熒光。當(dāng)熒光染料被平面偏振光激發(fā)后，發(fā)生熒光偏振，由于大分子比小分子旋轉(zhuǎn)得慢，熒光標(biāo)記的Acyclo終止堿基摻入寡核苷酸引物下游后偏振值將增加，故由此來(lái)確定哪一種熒光標(biāo)記的Acyclo終止堿基已被摻入整合。

1.5 主要儀器設(shè)備

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)特征

按照搜索策略檢索文獻(xiàn)，最終搜索到120篇文獻(xiàn)。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)：其中有92篇因不涉及-1195G/A突變、2篇為非病例對(duì)照研究、1篇無(wú)基因型數(shù)據(jù)被排除。最終余下25篇文獻(xiàn)可用于meta分析[6,8-31]。

有關(guān)納入的25篇文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)特征，見表1。在這25篇文獻(xiàn)中，有10篇文獻(xiàn)的研究對(duì)象為歐洲人群，12篇為亞洲人群，只有3篇報(bào)道為各人群混雜的美國(guó)人。各個(gè)研究的樣本容量范圍為107～1300，病例組和對(duì)照組的總樣本例數(shù)為9482和12206。對(duì)照組的基因分布頻率符合哈溫平衡。

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量

表1 納入本項(xiàng)研究的所有人群信息

對(duì)照組A等位基因的分布頻率在不同人群之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在亞洲人群中A等位基因頻率為0.46，顯著低于歐洲人群的0.75和混合人群的0.82。

在總的分析中，我們發(fā)現(xiàn)突變基因型與腫瘤發(fā)生在各個(gè)遺傳模型中均存在相關(guān)。純合子基因型AA vs GG（P=0.030，OR=1.23，95% CI：1.03～1.48, P =0.000），雜合子基因 AG vs GG（P=0.007，OR=1.13，95%CI：1.03～1.23，P=0.173）， 顯性模型 AA/AG vs GG（P=0.026，OR=1.15，95%CI：1.02～1.31，P=0.008），隱性模型 AA vs AG/GG（P=0.020, OR=1.14, 95%CI:1.02～1.28, P =0.000），見圖1。對(duì)人群進(jìn)行分層，A/G的突變是亞洲人群發(fā)生腫瘤的危險(xiǎn)因素，AA vs GG（P=0.001，OR=1.48，95%CI：1.18～1.86，P=0.000），AG vs GG（P=0.000，OR=1.20，95%CI：1.09～1.32，P=0.453），AA/AG vs GG（P=0.000，OR=1.28，95%CI：1.12～1.46，P=0.038），AA vs AG/GG（P=0.003，OR=1.33，95%CI：1.11～1.60，P=0.000）。同樣 ,在“其他”組中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果, AA vs GG（P=0.013，OR=1.31，95%CI：1.06～1.63，P=0.084），AG vs GG（P=0.084，OR=1.12，95%CI：1.00～1.27，P=0.232），AA/AG vs GG（P=0.051，OR=1.15，95%CI：1.02～1.31，P=0.092），AA vs AG/GG（P=0.004，OR=1.22，95%CI：1.07～1.09，P=0.050）。按照腫瘤的類型分層，只在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)1個(gè)陽(yáng)性結(jié)果。AG vs GG（P=0.018，OR=1.24，95%CI：1.04～1.49，P=0.038)，見表2。

圖1 Cox-2-1195G>A基因多態(tài)性與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

2.3 異質(zhì)性分析

總體而言，病例對(duì)照組的純合子基因型AA、雜合子基因AG、顯性模型AA/AG、隱性模型AG/GG與純合子基因型GG之間存在異質(zhì)性，P值分別為0.000、0.173、0.008、0.000。為了尋找組間異質(zhì)性來(lái)源，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分層分析，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性主要來(lái)源為種群因素而非腫瘤類型的差異。

2.4 敏感性分析

敏感性分析發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)Kristinsson[18]和Vogel[25]是歐洲人群產(chǎn)生異質(zhì)性的主要來(lái)源，移除這2篇文獻(xiàn)后再對(duì)數(shù)據(jù)分析，顯示異質(zhì)性降低。同理，Uede[14]是亞洲人群異質(zhì)性的來(lái)源。通過(guò)敏感性分析，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有其他文獻(xiàn)會(huì)影響總OR值，表明數(shù)據(jù)的結(jié)果是可靠的。

2.5 發(fā)表偏倚

Begger’s 漏斗圖和Egger’s 檢驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)發(fā)表偏倚。漏斗圖形狀顯示所有的基因型無(wú)明顯不對(duì)稱性。當(dāng)用Egger’s 檢驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，漏斗圖無(wú)不對(duì)稱性（AA/AG vs GG, P= 0.117），見圖 2。

圖2 AA/GG比GG模型發(fā)表偏倚檢測(cè)的Begger’s漏斗圖。每一點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)1個(gè)獨(dú)立的研究。Log [OR], 為OR值的自然對(duì)數(shù)。水平線，為平均效應(yīng)大小。

3 討論

本次meta分析納入了25個(gè)病例對(duì)照研究，包括9428個(gè)病例和12206個(gè)對(duì)照，探討了環(huán)氧合酶2 -1195G＞ A基因多態(tài)性和腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。我們的研究發(fā)現(xiàn)所有不同的基因型均能增加腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

表2 Cox-2-1195G>A基因多態(tài)性和腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

環(huán)氧合酶2的過(guò)表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的腫瘤性基因特征，如誘導(dǎo)抵抗細(xì)胞程序性死亡，調(diào)節(jié)胞外矩陣粘附力，促進(jìn)血管生成，增加轉(zhuǎn)移潛能和影響抗癌效果等[34-39]。近來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性-1195G＞A產(chǎn)生了一個(gè)c-MYB結(jié)合位點(diǎn)，從而提高了環(huán)氧合酶2基因的轉(zhuǎn)錄活性。c-MYB是一種在造血系統(tǒng)和胃腸道中有活性的轉(zhuǎn)錄因子，作用于多種基因調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化和生存過(guò)程中的精細(xì)平衡[40]，進(jìn)一步證明了-1195G>A的多態(tài)性可能改變個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性。但是，也有研究報(bào)道了-1195G的等位基因可降低腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。為了解決這一矛盾，我們對(duì)所有合乎條件的病例對(duì)照研究運(yùn)用meta分析來(lái)評(píng)估其相關(guān)性。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，-1195G>A的基因多態(tài)性在亞洲人群中顯示與腫瘤相關(guān)，但在歐洲人群和混雜人群中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，有遺傳背景的種族差異以及居住環(huán)境可能是引起這種現(xiàn)象的原因[41]。比如，對(duì)照組中亞洲人G等位基因頻率為0.46，在歐洲人群中，這一數(shù)值卻為0.75，隨后，獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)顯示這兩者之間存在顯著差異。腫瘤是一種多因素的復(fù)雜疾病，環(huán)氧合酶2-1195G＞A變異對(duì)腫瘤發(fā)展的影響可能還與一些暫未發(fā)現(xiàn)的基因有關(guān)。入選標(biāo)準(zhǔn)的不同和選擇偏倚等因素，也對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。上述原因都可以導(dǎo)致結(jié)果的不一致性。未見非洲人群-1195G>A的基因多態(tài)性研究，所以這種種族差異可能是由于樣本量較小產(chǎn)生的。因此，需要更多的研究特別是在非洲人群中的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，種族差異在基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系中是否起作用。

根據(jù)腫瘤類型進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示除了AG基因型的食管癌外，-1195基因型并沒(méi)有增加腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于-1195A等位基因是否增加食管鱗狀細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，各個(gè)研究結(jié)果間存在著差異[6,42-43]。Guo等[42]、Zhang等[6]、Hu等[19]的研究顯示環(huán)氧合酶2-1195G＞A與增加中國(guó)人群中的食管鱗狀細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)，且環(huán)氧合酶2的遺傳性變型可能影響食管癌的易感性。但是，Kristinsson等[18]研究指出Cox-2-1195GG基因型和AG/GG基因型增加了食管癌的風(fēng)險(xiǎn)。Moons等[17]論證了只有環(huán)氧合酶2AG純合子能增加食管癌的風(fēng)險(xiǎn)，該結(jié)論與我們研究的結(jié)果一致。不同的研究結(jié)果提示可能有多種因素參與基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)。事實(shí)上，吸煙[44]、幽門螺旋桿菌[19]、喝酒[45]、非甾體類抗炎藥[45-49]及種族差異均與食管癌相關(guān)，而且這些因素也可能與環(huán)氧合酶2基因型存在交互作用，或者可能是統(tǒng)計(jì)的混雜因素。然而，上述的研究中未完全包含這些因素，需要更多的研究進(jìn)一步探討各基因型與這些因素之間的關(guān)系。在結(jié)直腸癌的研究中，只有一個(gè)報(bào)道[15]了-1195G>A等位基因與中國(guó)人群結(jié)直腸癌有關(guān)，其余研究均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性相關(guān)。鑒于這一亞洲人群中唯一的陽(yáng)性結(jié)果，需要我們進(jìn)行大樣本的研究來(lái)驗(yàn)證其結(jié)果。在“其他”項(xiàng)的研究中，將一些單個(gè)獨(dú)立的研究合并后，其OR值顯示-1195G>A基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。對(duì)于不同類型腫瘤，-1195G>A基因多態(tài)性可能作用不同。即使相同部位的腫瘤中，由于遺傳的基因多態(tài)性對(duì)腫瘤的影響，再加上一些研究的樣本量相對(duì)較小，所以一些較小的聯(lián)系在這些研究中就不會(huì)檢測(cè)出來(lái)，從而導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致性。將單個(gè)或不同類型的腫瘤合并后，選擇偏倚會(huì)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。比如，關(guān)于淋巴瘤的研究只有兩個(gè)，樣本量有限，所以在對(duì)其結(jié)果下結(jié)論時(shí)需謹(jǐn)慎。需要更多前瞻性的研究來(lái)評(píng)估環(huán)氧合酶2過(guò)表達(dá)與疾病間的關(guān)系。

本次meta分析仍存在一定的局限性：① 所有納入的文獻(xiàn)都是英文的，可能漏掉了一些用其他語(yǔ)言發(fā)表的合適的研究；② 總結(jié)果為各個(gè)研究未經(jīng)矯正的OR值計(jì)算而來(lái)，一些潛在的混雜因素需被校正（如年齡、性別、吸煙和環(huán)境因素等）；③ 可能存在誤分類而影響分析結(jié)果；④ 出版偏倚，可能有合適的研究還未在線發(fā)表或出版。

本研究的優(yōu)勢(shì)：① 在盡可能多的研究中提取數(shù)據(jù)，大大增加了本研究的效力；② 符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例對(duì)照研究質(zhì)量良好；③ 在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)發(fā)表偏倚，使得結(jié)果更可信。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶2-1195G＞A基因多態(tài)性與總?cè)巳旱哪[瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，在亞洲人群中更為顯著。遺傳分布的種族差異起了很大的作用。環(huán)氧合酶2-1195G＞A基因多態(tài)性可能觸發(fā)環(huán)氧合酶2的過(guò)表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。需要進(jìn)一步運(yùn)用蛋白水平的研究來(lái)闡明基因多態(tài)性在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的影響，以及基因-基因、基因-環(huán)境間的交互作用等。

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