大黃素對腸黏膜屏障損傷的保護作用及機制研究

白小武，嵇 武，丁博文，張 強，李秋榮，李 寧

(本文編輯:潘雪飛; 英文編輯:王建東)

腸缺血再灌注(IR)是臨床多種疾病的病理生理過程，進一步發展可以導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)等的發生。研究表明大黃素對腸缺血再灌注損傷有保護作用，故本實驗采用大鼠腸缺血再灌注模型，觀察大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜細胞凋亡及緊密連接破壞的影響，探討大黃素保護腸黏膜屏障的機制，為臨床治療腸缺血再灌注提供理論依據，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性健康清潔級SD大鼠48只，8～9周齡，體重200～250 g，由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供，實驗動物使用許可證號:SYXK(軍)2007-029;飼養室溫度22～23℃，環境濕度50%，喂以標準的大鼠飲食。

1.2 藥物與試劑 大黃素購于中國藥品生物制品檢定所;兔抗大鼠Claudin-1抗體和Occludin抗體購于Santa Cruz公司;脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的末端標記法(TUNEL)染色試劑盒、山羊抗兔IgG-HRP二抗、牛血清白蛋白(BSA)購于南京碧波生物科技有限公司;β-actin抗體購于北京博奧森生物技術有限公司;考馬斯亮藍蛋白濃度試劑盒購于南京建成生物工程研究所;全蛋白酶抑制劑混合片購于羅氏公司;Western Blot上樣緩沖液購于Fermentas公司。

1.3 主要實驗儀器 JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.4 動物分組及模型制作 48只SD大鼠正常喂養1周后隨機分為假手術(S)組、模型(IR)組、模型+生理鹽水(IRS)組和模型+大黃素(IRE)組，每組12只。大黃素用生理鹽水配制成10 g/L的混懸液備用。IRE組按40mg/(kg·d)劑量給予大黃素灌胃，IRS組給予等量的生理鹽水灌胃，兩組均為1次/d，連續7 d。實驗第7天給藥2 h后，采用腸系膜上動脈(SMA)夾閉/松夾方法制備腸缺血再灌注模型［1］。假手術組只分離SMA，不夾閉;缺血30 min，再灌注2 h后麻醉大鼠、開腹取距回盲部5 cm處回腸標本。

1.5 病理組織學觀察 取2 cm回腸標本置于10%的中性甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察病理變化，按照Chiu’s損傷分級評分［2］。

1.6 透射電鏡觀察 將回腸標本修成1 mm×1 mm×5 mm大小，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，脫水、浸透、包埋、超薄切片，透射電子顯微鏡觀察腸黏膜上皮細胞間緊密連接的改變。

1.7 腸黏膜細胞凋亡指數檢測 取1cm回腸標本迅速凍于液氮中，冰凍切片，按照TUNEL試劑盒說明書染色，光學顯微鏡下觀察。400倍視野內每組隨機選取100個相鄰視野，計算凋亡指數。

1.8 Western Blot半定量測定 Claudin-1、Occludin蛋白含量 取3 cm回腸標本，縱向剪開腸腔，用載玻片輕輕刮取并收集腸黏膜，置于－20℃保存。將保存組織放入組織勻漿器內，每100 mg加1 ml全蛋白提取液(0.15 mol/L氯化鈉+0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷+1.0%聚氧乙烯辛基苯基醚，每10 ml+全蛋白酶抑制劑混合片1片)研磨。12000r/min(離心半徑6 cm)，4℃離心20 min，取上清液，測定總蛋白含量。分別取40μg的總蛋白加入上樣緩沖液，煮沸10 min后，先行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5 g/L BSA室溫封閉1 h，加入 Claudin-1、Occludin 和 β-actin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜，漂洗后加入IgG-HRP二抗(1∶3000)，室溫孵育1 h，漂洗、曝光成像。QuantityOne軟件分析測定結果，計算目標蛋白相對含量=目標蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.9 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差(±s)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法(Claudin-1、Occludin的含量)，方差不齊時用Dunnett T3法(Chiu’s評分、凋亡指數)，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃素對腸黏膜組織細胞超微結構的影響 S組腸道黏膜形態完整，絨毛結構清晰，有部分絨毛尖端上皮下間隙略增寬，緊密連接和橋粒結構清晰，形態完整，可見大量微絨毛，排列整齊。IR組腸道黏膜結構紊亂，絨毛破損，上皮細胞大量脫落，固有層暴露、出血，炎癥細胞在內皮下聚集，微絨毛大量脫落、斷裂，緊密連接結構模糊、腫脹，致密物質減少。IRS組病理表現、電鏡表現與IR組相似。IRE組與IR組和IRS組比較，腸黏膜損傷程度較輕，上皮下間隙擴張，部分絨毛頂端破損、脫落，毛細血管充血，電鏡下破壞明顯減輕，微絨毛增多，緊密連接結構大致可見，腫脹緩解(圖1、圖2)。統計分析，與S組相比，IR組、IRS組、IRE組病理損傷明顯嚴重(P＜0.05);IR組與IRS組比較無明顯差別(P＞0.05);而IRE組與IR組、IRS組相比病理損傷明顯減輕(P＜0.05)。見表1。

2.2 大黃素對腸黏膜細胞凋亡指數的影響 S組上皮及隱窩處可見少量凋亡細胞。IR組可見彌散性分布的凋亡細胞，數量明顯增加。IRS組與IR組結果相似。IRE組與IR組相比凋亡細胞數量明顯減少(圖3)。統計分析，與S組相比，IR組、IRS組、IRE組凋亡細胞數量增多(P＜0.05);IR組與IRS組相比無明顯差別(P＞0.05);而IRE組與IR組、IRS組相比凋亡細胞數量減少(P＜0.05)。見表1。

2.3 大黃素對腸黏膜緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin含量的影響 S組正常表達Claudin-1、Occludin蛋白;IR組和IRS組Claudin-1、Occludin蛋白表達明顯下調(P＜0.05)，兩者之間無明顯差異(P＞0.05);IRE組 Claudin-1、Occludin蛋白表達明顯高于IR組和IRS組(P＜0.05)。見表1。

圖1 四組大鼠回腸病理改變(HE×200)

圖2 四組大鼠腸黏膜上皮細胞超微結構電鏡變化(×50000)

圖3 四組大鼠腸黏膜細胞凋亡的TUNEL檢測(二氨基聯苯胺染色 ×400)

表1 四組大鼠腸黏膜屏障損傷指標比較(±s)

表1 四組大鼠腸黏膜屏障損傷指標比較(±s)

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 IR組比較，#P ＜0.05;與 IRS組比較，ΔP ＜0.05

組別 n Chiu’s病理評分 凋亡指數(%) Claudin-1(相對含量) Occludin(相對含量)S 組 12 0.44 ±0.66#Δ 1.04 ±0.96#Δ 7.22 ±0.85#Δ 2.24 ±0.53#Δ IR 組 12 3.40 ±0.97* 10.77 ±2.22* 3.68 ±0.85* 1.26 ±0.46*IRS 組 12 3.36 ±1.02* 10.69 ±2.22* 3.46 ±0.78* 1.13 ±0.38*IRE 組 12 2.47 ±0.98*#Δ 6.54 ±1.94*#Δ 7.34 ±1.28#Δ 2.29 ±0.48#Δ

3 討論

腸缺血再灌注損傷是休克、創傷、感染等多種臨床常見疾病重要的病理生理環節，可以引起腸黏膜屏障受損，進一步發展可導致腸內細菌及內毒素移位，誘發SIRS、MODS和腸源性感染。腸缺血再灌注導致腸黏膜屏障受損的機制是一個復雜的過程，目前還未完全闡明，主要包括組織氧代謝障礙、氧自由基損傷、細胞因子和炎癥介質的作用、白細胞與內皮細胞的相互作用等。西醫預防和治療腸黏膜屏障受損的措施一直存在不足之處，相關研究也未取得突破性進展［3］。近年來，人們逐漸把治療研究的重點轉移到了中醫藥方面，并取得了一些成就［4］。現代研究證實大黃素具有改善腸道血液循環、促進腸道蠕動、刺激腸道分泌和殺滅微生物、降低腸道黏膜通透性、抗炎及免疫調節等作用。在急性重癥胰腺炎中，大黃素可以顯著降低血清淀粉酶、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6的水平，減輕胰腺組織病理損傷，抑制NF-κB(核因子)活化，誘導細胞因子TGF-β1(人轉移生長因子β1)基因的表達，促進多種細胞外基質成分合成，增加胰腺組織DNA合成和蛋白含量，參與胰腺組織的再生和修復。亦有研究證實大黃素對重癥胰腺炎所致腸黏膜屏障損傷也具有保護作用，通過抑制小腸潘氏細胞分泌的隱凹素-4mRNA的下調［5］，并下調Bax(促凋亡因子)基因的表達抑制腸黏膜細胞過度凋亡，從而減輕腸黏膜屏障的損害，降低腸道內毒素的易位［6］。大黃素可以通過增加大鼠肝移植后Bcl-2(B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白)蛋白表達，抑制肝細胞的凋亡，從而減輕急性排斥反應程度［7］。大黃素預處理在肝臟缺血再灌注時可以降低丙二醛的含量，減輕了脂質過氧化損害程度［8］。本實驗觀察了大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜病理組織學的影響，大黃素預處理組腸黏膜病理損傷明顯減輕，Chiu’s評分降低，從而從病理學的角度明確了大黃素對腸缺血再灌注腸黏膜屏障具有保護作用。

腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、免疫屏障［9-10］及化學屏障構成，其中機械屏障是腸黏膜屏障的根本。機械屏障的結構基礎是腸黏膜上皮細胞及細胞與細胞之間完整的連接。其中腸黏膜上皮細胞死亡的主要方式是細胞凋亡，約占死亡細胞總數的80%。在腸缺血再灌注的過程中，細胞凋亡起了非常重要的作用。腸黏膜細胞凋亡的增加與腸缺血再灌注損傷密切相關［11］。大量的凋亡導致腸黏膜屏障功能障礙，上皮細胞通透性增加，腸內細菌和內毒素移位［12］。本研究結果顯示大黃素預處理可以減少腸缺血再灌注造成的腸黏膜細胞凋亡。

細胞與細胞之間的連接方式有多種，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接，最主要的方式是緊密連接。緊密連接的破壞可以導致水和物質跨上皮轉運的紊亂，是腸黏膜屏障受損的重要環節。緊密連接破壞的最重要的標志是緊密連接蛋白的減少。本實驗結果顯示，大黃素預處理組腸缺血再灌注腸黏膜上皮之間緊密連接的破壞明顯減輕，微絨毛增多，緊密連接蛋白的含量增多。

上述研究證實大黃素可以保護腸黏膜細胞減少凋亡，保護緊密連接結構減少破壞，維護腸黏膜屏障的完整性，降低腸黏膜通透性，進一步證實了大黃素對腸道缺血再灌注所致腸黏膜屏障損傷具有保護作用，為大黃素在腸黏膜屏障損傷中的預防和治療提供了理論依據。

［1］陳宇鵬，張家衡，柯有力，等.加味枳術湯對鼠腸缺血-再灌注早期小腸黏膜細胞凋亡的影響［J］.腹部外科，2010，23(1):49-50.

［2］Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，etal.Intestinalmucosal lesion in low-flow states［J］.Arch Surg，1970，101(4):478-483.

［3］張育才，匡重伸，曾因明.鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響［J］.東南國防醫藥，2007，9(4):241-242，245.

［4］Song WB，Wang YY，Meng FS，etal.Curcumin protects intestinal mucosal barrier function of ratenteritis via activation ofMKP-1 and attenuation of p38 and NF-kappaB activation［J］.PLoS One，2010，5(9):12969.

［5］趙金鋒，劉世賓，羅 靜，等.大黃及丹參注射液對實驗性急性胰腺炎小鼠小腸隱凹素-4基因表達影響的研究［J］.中國中醫藥科技，2010，17(1):34-35.

［6］寧建文，季 峰，駱丹東，等.大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜細胞凋亡和血清瘦素表達的影響［J］.中西醫結合學報，2009，7(12):1167-1173.

［7］孟珂偉，宋占文，周先亭，等.大黃素對大鼠肝移植后急性排斥反應中肝細胞凋亡的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(5):833-836.

［8］林勝璋，余耀軍，游 濤，等.大黃素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的預防作用［J］.中國中西醫結合外科雜志，2006，12(2):136-138.

［9］Rescigno M.The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity［J］.Trends Immunol，2011，32(6):256-264.

［10］Cario E.Heads up!How the intestinal epithelium safeguardsmucosal barrier immunity through the inflammasome and beyond［J］.Curr Opin Gastroenterol，2010，26(6):583-590.

［11］Lopez-Neblina F，Toledo AH，Toledo-Pereyra LH.Molecular biology of apoptosis in ischemia and reperfusion［J］.J Invest Surg，2005，18(6):335-350.

［12］Liu C，LiA，Weng YB，etal.Changes in intestinalmucosal immune barrier in ratswith endotoxemia［J］.World JGastroenterol，2009，15(46):5843-5850.