放射性碘-131標記酪氨酸*

李澤軍 褚泰偉

(北京大學化學與分子工程學院 北京 100871)

目前, 放射性標記技術已經被廣泛應用于化學、生物學和醫學等領域，例如化學反應機理的研究、放射性免疫分析以及疾病的早期診斷和治療等。因此，在本科生綜合化學實驗中開展與放射化學相關的實驗，讓學生掌握該學科的基本知識和操作常識，是有意義的。

放射性碘-131具有半衰期短(8.02天)，價格便宜，易于購買等優點。放射性碘標記化合物在生物學和醫學中應用很廣泛，是常用的示蹤手段之一。常用的標記方法為利用氧化劑，如氯氨-T(Chloramine-T)、Iodogen、溴代琥珀酰亞胺(NBS)等將放射性碘負離子氧化為具有親電活性的放射性碘，這些放射性碘進而和化合物中的苯環發生親電取代反應以完成標記[1-5]。酪氨酸分子中有被羥基取代的苯環，易于發生親電取代反應，易于被碘標記。如欲對蛋白質或其他化合物進行碘標記，需先將酪氨酸及其衍生物與蛋白質或其他化合物偶聯，然后再完成放射性碘的標記[6]。本實驗利用氯氨-T、Iodogen為氧化劑，氧化碘-131負離子(131I-)標記酪氨酸分子。研究了不同的標記條件，如：溶液pH、底物濃度、氧化劑用量、載體加入量對標記率的影響，從而尋找最佳標記條件。通過該實驗，學生可以初步掌握放射性碘標記化合物的常用方法，同時訓練放射化學操作的基本技能。

1 實驗目的

(1) 了解放射性碘標記化合物的原理；

(2) 了解放射性碘標記化合物的兩種常用實驗技術與方法；

(3) 了解不同標記條件對標記率的影響。

2 實驗原理

氯氨-T和Iodogen是碘標記化合物常用的氧化劑，其分子結構如圖1所示。氯氨-T是水溶性的，在水溶液中生成HOCl，將放射性I-氧化為放射性的I2，放射性的I2進而和化合物的苯環發生親電取代反應，制得碘標記化合物[3]。Iodogen標記化合物的原理和氯氨-T一致，但Iodogen不溶于水，標記化合物時可以減少與水溶性有機分子的接觸從而減少其氧化損傷，所以氧化條件較為溫和[7-8]。氯氨-T氧化標記法和Iodogen氧化標記法是碘標記化合物常用的兩種方法。

酪氨酸由于分子內部有被羥基活化了的苯環，碘的親電取代反應很容易在羥基的鄰位發生。因此，很容易被碘標記成功。其反應式如圖2所示。

圖1 兩種常用氧化劑的分子結構

圖2 放射性碘-131標記酪氨酸分子

本實驗采取紙上色譜法來確定標記率。由于碘標記的酪氨酸分子和未被標記上的131I-性質不同，它們在固定相和流動相(展開劑)之間的分配比不同。因此，在流動相展開過程中，被標記的酪氨酸分子和未被標記上的131I-隨溶劑的移動速度不同而被分離開，放射性被分布于紙帶的不同區域。標記率即為標記化合物區域的放射性活度占整條紙帶的放射性活度的百分比。

3 實驗試劑和儀器

無載體Na131I溶液(原子高科股份有限公司)，酪氨酸(上海康捷生物科技發展有限公司)，氯氨-T(ACROS ORGANICS)，Iodogen(Sigma)，甲醇(分析純)，正丁醇(分析純)，冰醋酸(分析純)，Na2S2O5(分析純)，去離子水，85%磷酸(分析純)，KOH(分析純)，氯仿(分析純)，色譜用濾紙(寬1.5cm，長25.0cm)，玻璃展開缸，FT-603井型γ閃爍探頭和FH463A-自動定標器(中核(北京)核儀器廠)。

4 實驗步驟

4.1 溶液配制和原料準備

(1) 0.1mol/L KOH水溶液用85%的磷酸溶液調pH=3、5、7、9、11。

(2) 將酪氨酸分別溶于pH 3～11的KOH-H3PO4溶液中，質量濃度為0.2mg/mL。

(3) 將酪氨酸溶于pH 7的KOH-H3PO4溶液中，質量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL。

(4) 配制氯氨-T水溶液，質量濃度分別為0、1、2、3、4mg/mL。

(5) 配制Iodogen的氯仿溶液，質量濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL。分別取0.5mL上述溶液于離心管中，在通風櫥中揮發干氯仿，Iodogen被涂于離心管內壁，制得不同Iodogen含量的離心管若干。

(6) 配制Na2S2O5水溶液，質量濃度為30mg/mL。

(7) 在距離濾紙條一端2cm處標記好點樣位置，每隔1cm畫一個標記，共畫10cm。

(8) 配制85%甲醇展開體系，取適量展開劑于玻璃展開缸中。

4.2 色譜展開條件的選擇

4.3 溶液pH對標記率的影響

以氯氨-T為氧化劑：分別取pH 3～11的酪氨酸溶液(0.2mg/mL)0.5mL于離心管中，加入10 μL氯氨-T溶液(2mg/mL)，1.85MBq Na131I溶液，反應10分鐘后加入50μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應。

以Iodogen為氧化劑：取0.04 mg/mL Iodogen的氯仿溶液揮干溶劑后的離心管5支，分別加入pH 3～11的酪氨酸溶液(0.2mg/mL)0.5mL，加入1.85MBq Na131I溶液，反應10分鐘后加入50μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應。

用做好標記的濾紙條，對以上反應液點樣分析。在正丁醇-冰醋酸-水的展開體系中展開10cm，記下溶劑前沿。風干后剪成1cm寬的紙片裝入一次性塑料試管中，用FT-603井型γ閃爍探頭測量其放射性，計算標記率。

4.4 底物質量濃度對標記率的影響

分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑，取質量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL的酪氨酸溶液0.5mL(pH 7)，其他標記條件同4.3節，反應結束后分析產物，方法同4.3節。

4.5 氧化劑用量對標記率的影響

以氯氨-T為氧化劑：取酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)0.5mL，分別加入10μL 0、1、2、3、4mg/mL的氯氨-T溶液，1.85MBq Na131I溶液，反應10分鐘后加入50 μL Na2S2O5溶液(30mg/mL)終止反應。

以Iodogen為氧化劑：取酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)0.5mL，分別加入由0.5mL 0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL Iodogen的氯仿溶液揮干溶劑后的離心管，加入1.85MBq Na131I溶液，反應10分鐘后加入50μL Na2S2O5(30 mg/mL)溶液終止反應。反應結束后分析產物，方法同4.3節。

4.6 載體加入量對標記率的影響

分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑，將0、50、100、500、1000μg載體KI與1.85MBq Na131I溶液混合后加入酪氨酸溶液(0.2mg/mL，pH 7)，其他標記條件同4.3節。反應結束后分析產物，方法同4.3節。

5 結果與討論

5.1 溶液pH對標記率的影響

研究了不同溶液pH對標記率的影響，結果如表1所示。分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時，最大標記率均在pH 7(氯氨-T：80%，Iodogen：83%)。表明中性溶液為最佳的標記條件，酸性溶液和堿性溶液對碘標記不利。這可能是由于酪氨酸分子中的酚羥基和氨基結構隨溶液pH變化影響碘標記所致。

表1 不同pH條件下的標記率

5.2 底物質量濃度對標記率的影響

研究了不同底物質量濃度對標記率的影響，結果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時，不同的底物質量濃度(0.05～0.3mg/mL)均可達到80%的標記率，這表明在0.05～0.3mg/mL范圍內，底物質量濃度對標記率影響不大。

5.3 氧化劑用量對標記率的影響

研究了不同氧化劑用量對標記率的影響，結果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時(圖3)，用量為0.02mg即可達到最大標記率(氯氨-T：80%，Iodogen：83%)；進一步增加氧化劑用量對標記率影響不大。因此，在標記化合物時，可將氧化劑用量控制在最低，這樣有利于保護被標記的分子。

5.4 載體加入量對標記率的影響

研究了不同載體加入量對標記率的影響，結果表明分別以氯氨-T和Iodogen為氧化劑時，加入50μg載體KI即可使標記率明顯下降(氯氨-T：50%，Iodogen：35%)；載體加入量超過100μg，標記率降低至15%以下(圖4)。這可能是由于載體I-與131I-之間的競爭所致。

圖3 氧化劑用量對標記率的影響

圖4 KI加入量對標記率的影響

6 結論

本實驗探索了放射性碘-131標記酪氨酸分子不同的標記條件，結果表明：中性溶液有利于碘標記；增加氧化劑用量可以提高標記率，但應盡量將氧化劑用量控制在最低；少量的載體加入量即明顯降低標記率。因此，溶液pH、氧化劑用量和載體加入量對標記率影響最大。

7 實驗注意事項

因本實驗涉及放射性實驗操作，應注意以下事項：(1) 所有放射性操作應該戴乳膠手套進行，禁止戴手套觸摸實驗藥品、公用儀器、門窗把手等。(2) 所有放射性操作應該在鋪有吸水紙的搪瓷盤中進行，以防止污染。一旦發現污染應立即向老師匯報。(3)穿實驗室統一配備的實驗服，禁止將實驗服帶出實驗室。(4) 實驗廢物和廢液要統一回收處理，禁止亂扔亂倒。(5) 學生離開實驗室前要洗手，并檢測手和衣物是否被污染，確定無污染方可離開實驗室。

本實驗可作為大三或大四本科生的綜合化學實驗。如學時安排有限，可省略某些步驟。如：色譜展開條件的選擇和底物濃度對標記率的影響；或者改為只利用一種氧化劑在不同標記條件下進行標記。學生通過本實驗能初步掌握放射性的基本操作，增強對放射性及輻射防護基本知識的了解，這樣有利于學生克服對放射性的恐懼心理，激發他們對放射化學的興趣。

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