分子印跡整體萃取柱的制備及其應用*
——介紹一個綜合化學實驗

張靜 王玲玲

(陜西師范大學化學與化工學院 陜西西安 710062)

在武漢大學主編的《分析化學》(第4版)中增加了固相萃取和固相微萃取的內容，但在分析化學實驗課的內容中，實驗對象多為簡單樣品，多數情況下學生不需要進行復雜的樣品前處理就可以直接進行測定。因此，我們在課堂教學中強調分析過程包括取樣、試樣的處理與分解、分離與富集、分析方法的選擇與分析測定、分析結果的計算與評價，共5步。但在實驗中，學生對此體會并不深刻。此外，傳統實驗以開設驗證性實驗和簡單實驗為主，設計性內容較少，涉及到的現代新技術、新應用的內容也比較少，這不利于調動學生學習的積極性和主動性，也不利于培養學生的綜合能力。

綜合實驗是在學生完成基礎課程學習的基礎上開設的一門實驗課程，在內容上不局限于一門課程的內容，可以包含在大學前幾年中學習的所有內容，同時實驗課時也比基礎實驗課時長，能為學生提供一個應用所學知識解決問題的體驗過程，并在此過程中培養學生的學習興趣，提高他們解決問題的能力。下面結合教師的科研工作介紹一個適合化學專業三、四年級學生的綜合型實驗。

1 實驗目的

(1) 讓學生從問題出發，完成從取樣、樣品制備、分析條件優化到樣品測定及數據處理的分析全過程，培養學生綜合分析問題和解決問題的能力。

(2) 了解分析化學的新內容及進展，學習固相萃取技術。

(3) 了解以士的寧為模板的分子印跡整體聚合物的原位制備方法。

2 實驗原理

分子印跡技術(molecular imprinting technique, MIT)是指為獲得在空間結構和結合位點上與某一特定目標分子(也稱模板分子或印跡分子)完全匹配的聚合物的制備技術，具有構效預定性、識別專一性和廣泛實用性3大特性[1]。其基本原理如圖1所示。模板分子先與功能單體相互結合形成超分子復合物，然后在交聯劑作用下，形成三維交聯高分子聚合物；當在一定洗脫條件下除去模板分子后，即可得到具有識別空腔的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)。這種聚合物與含有模板分子的待測溶液接觸時，能對模板分子顯示出高選擇性的結合能力，即分子識別能力[2]。MIPs具有特異選擇性、識別專一性和廣泛實用性，同時又具有物理化學穩定性和機械強度好、保存方便、使用壽命長和制備簡單等特點[3]。因此，MIPs在色譜分離、固相萃取、臨床藥物分析、膜分離、模擬酶催化和仿生傳感器等領域的應用日益廣泛，尤其在樣品前處理領域顯示出獨特的優勢。

圖1 分子印跡聚合物的制備原理

3 實驗儀器及藥品

3.1 藥品

士的寧標準品，馬錢子堿標準品；α-甲基丙烯酸(MAA)，使用前減壓蒸餾；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，使用前用10%氫氧化鈉溶液萃取3次，再用去離子水洗滌3次，最后用無水硫酸鎂干燥；偶氮二異丁腈(AIBN)，使用前用乙醇重結晶；三甲氧基丙烯基硅烷；十二醇，甲醇，乙腈，磷酸二氫鉀，乙酸，鹽酸，磷酸，氯仿，三乙胺，氫氧化鈉，甲苯，無水硫酸鈉，以上試劑均為分析純。

市售的萬通筋骨片、風濕關節炎片、胃爾康片和腰痛寧膠囊等藥品。

3.2 儀器

HSS-1(B)型恒溫浴槽(成都儀器廠)；PHS-3C型PH計(上海精密科學儀器有限公司)；KQ2200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS124S電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)；日本島津20A液相色譜系統：包括兩臺LC-20AT、一臺SPD-20A和六通進樣閥，工作站：N2000；Eclipse XDB-C18柱。

4 實驗內容

4.1 分析條件的建立及標準曲線的繪制

色譜條件為：色譜柱，Eclipse XDB-C18柱；流動相：甲醇-乙腈-KH2PO4(10mmol/L)-三乙胺(用H3PO4調pH至2.50)(體積比為5:10:85:0.5)等度洗脫，流速0.5mL·min-1；檢測波長254nm，進樣體積為20μL；柱溫30℃。在此色譜條件下，分別取質量濃度0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50和0.75g·L-1的士的寧標準溶液進樣，記錄色譜圖；以標準溶液的峰面積對濃度繪制標準工作曲線，并計算工作曲線的線性范圍及線性相關系數。每個濃度樣品重復測定3次，并計算相對標準偏差(RSD)。

4.2 分子印跡整體聚合物的制備

4.2.1 玻璃管的預處理

先用水洗干凈玻璃管(d=0.5cm，L=5.0cm，尺寸可以根據實際情況調節，也可用玻璃滴管)，再用1mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡2小時，取出水洗后，用2.0mol·L-1鹽酸溶液浸泡2小時，取出用去離子水洗至中性，放入烘箱烘2～3小時后取出備用[4]。向處理好的玻璃管中加入通氮氣除氧的5%硅烷化試劑的甲苯溶液，密封兩端，在90℃下靜置2小時。

4.2.2 士的寧分子印跡聚合物的合成

將25.5mg模板分子士的寧、0.025mL單體甲基丙烯酸、0.22mL交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、致孔劑(0.07mL甲苯、0.39mL十二醇)依次加入容器中，超聲處理使其成為均一體系，加入2.4mg引發劑偶氮二異丁腈超聲處理至完全溶解，通氮氣5分鐘，然后將上述溶液加入硅烷化處理過的玻璃管中，用硅膠頭密封兩端，在50℃恒溫水浴條件下聚合[5]。反應12小時后，打開兩端的密封頭，采用如圖2的裝置，用甲醇-乙酸(體積比為4:1)溶液沖洗玻璃管柱，直至洗脫液中檢測不出模板分子士的寧(用紫外-可見分光光度計或液相色譜對洗脫液進行檢測)。

制作空白柱時，除不加模板分子外，均按照上述方法制備。

圖2 洗滌模板裝置

4.3 洗脫條件的優化

4.3.1 甲醇比例

準確吸取0.50mL質量濃度為1.0g·L-1的士的寧水溶液，加到制備的萃取柱中，用甲醇比例(體積分數)分別為30%、40%、50%、60%、70%的水溶液0.50mL作清洗液和洗脫液(清洗總體積均為2.0mL)，收集洗脫液，空氣流吹干，定容到0.10mL，取20μL用液相色譜測定其含量，通過與標準溶液的峰面積比例計算回收率。以回收率最低的甲醇比例作為清洗液中的甲醇比例；以回收率最高的甲醇比例作為洗脫液的甲醇比例。

4.3.2 pH

同4.3.1，以pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸緩沖液和甲醇混合液(體積分數為50%)為洗脫液測定回收率，以回收率最低的pH作為清洗液的酸度；以回收率最高的pH作為洗脫液的酸度。

4.4 回收率測定

分別取0.050、0.10和0.15mL質量濃度為1.0g·L-1的士的寧水溶液，加到制備的萃取柱中，用4.3確定最佳條件的清洗液洗4次，每次0.50mL，再用4.3確定最佳條件的洗脫液洗脫4次，收集洗脫液，空氣流吹干，定容到0.10mL，取20μL，用液相色譜測定含量，每個濃度的樣品測定3次，計算回收率及標準偏差。非印跡柱的回收率同法測定。

4.5 識別能力考查

選取與士的寧結構相似的馬錢子堿作為競爭分子，同4.3的方法，測定馬錢子堿在固相萃取小柱上的回收率，通過比較馬錢子堿和士的寧的回收率考察得到的固相萃取小柱的專屬性。

4.6 樣品制備

選取含士的寧的中藥(如萬通筋骨片、風濕關節炎片、胃爾康片和腰痛寧膠囊等)去除糖衣后研細，準確稱取1.0000g，置于帶塞的錐形瓶中，加3.0mL氫氧化鈉溶液，調節pH=9.0，放置30分鐘；然后加20mL氯仿，分3次萃取，收集萃取液，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙過濾，置水浴中蒸干氯仿。加2.0mL甲醇溶解，得萃取溶液[6]。

4.7 樣品測定

準確吸取0.50mL萃取液，注入制備的萃取柱中，同4.4的方法測定，記錄色譜圖并計算樣品中的士的寧含量。圖3為實際樣品的色譜分離圖，圖中約8分鐘處的峰為士的寧的色譜峰。對比圖3中的線段2和3，可以清楚地看到士的寧分子印跡固相萃取柱可以有效地純化和富集樣品中的士的寧。

圖3 實際樣品的色譜分離圖1 標準士的寧溶液；2 經過固相萃取柱后的樣品；3 未經處理的樣品

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱；流動相：甲醇-乙腈-KH2PO4(10mmol/L)-三乙胺(pH2.5，體積比5:10:85:0.5)等度洗脫，流速0.5mL/min；檢測波長254nm，柱溫30℃

5 數據處理

(1) 在建立的色譜條件下繪制士的寧的工作曲線，包括線性范圍、線性相關系數、標準偏差。

(2) 分別計算士的寧和馬錢子堿在印跡柱和非印跡柱上的回收率。

(3) 計算樣品中的士的寧含量。

6 實驗注意事項

(1) 對玻璃管進行預處理是為了防止整體柱柱床與玻璃管內壁間產生裂縫。由于硅烷化試劑易與水和醇反應而失效，所以應干燥保存；在處理玻璃管時，一定要保證玻璃管內壁干燥。

(2) 在合成聚合物時，如果室溫較高(超過25℃)，加入引發劑偶氮二異丁腈后，在進行超聲處理和通氮氣時，最好將反應混和液放在冰浴中，以防止在容器中發生聚合反應。

7 總結

分子印跡整體萃取柱的制備及其應用作為化學相關專業學生的綜合實驗，能使學生從解決生活中的實際問題出發，通過取樣、樣品制備、分析條件優化、樣品測定及數據處理等步驟，體驗從提出問題到解決問題的全過程。本實驗能引發學生進行思考，使他們更全面地理解和運用課堂知識，有利于培養學生分析問題和解決問題的能力；同時，實驗中使用的樣品直接來自生活，在實驗內容中融合了樣品前處理領域的新技術和新方法，可以有效地激發學生的科研積極性和學習興趣。

[1] Jafari M T,Rezaei B,Zaker B.AnalChem,2009,81(9):3585

[2] Haupt K,Mosbach K.ChemRev,2000,100(7):2495

[3] Haupt K.ChemCommun,2003(2):171

[4] 張靜,賀浪沖,傅強.分析化學,2005,33(1):113

[5] Zhang J,Yue X F,Liang P P.JLiqChromatogrRelatedTechnol,2010,33(6):770

[6] 劉剛,周健,羅毅.廣東藥學院學報,2003,19(3):211