芥菜型油菜A9染色體黃籽基因區域BAC重疊群的構建

王 卓，袁玉輝，胡學芳，劉顯軍，劉旭東，劉忠松

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128）

油菜是重要的油料作物，包括白菜型、芥菜型和甘藍型三種類型，這三種類型的油菜具有共同的白菜來源的A 基因組[1]。A9 染色體是A 基因組中最長的染色體，長約37 Mb。A9 染色體上有控制種子大小[2]、種皮顏色[3]、硫苷合成[4－5]、油脂合成[6]等重要性狀的基因。研究者對A9 染色體進行了大量研究，定位了大量SSR 標記，發現了許多基因[7-15]。Wang 等[16]公布了應用新一代測序方法測定的白菜基因組序列，為將這些標記、基因定位到A9 染色體對應BAC 和Scaffold 提供了基礎。Mun 等[17]構建了由67468 個BAC 克隆組成的第一張白菜全基因組物理圖譜，圖譜上有242 個分布在10 個連鎖群上的重疊群，長約717 Mb，對加速基因組序列分析、BAC 克隆序列的整合，以及蕓薹屬物種間的比較基因組研究起著重要的作用。

研究利用已構建的ZBjH BAC 文庫，用A9 染色體上的標記進行PCR 步移篩選，構建重疊群，并與已測序的白菜A9 染色體物理圖譜進行比較，分析蕓薹屬植物A9 染色體的進化和變異。構建芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區域物理圖譜有助于黃籽候選基因的獲得，為芥菜型油菜與白菜（白菜型油菜）、甘藍型油菜A9 染色體進行比較物理作圖提供基礎，并為A9 染色體遺傳圖譜的加密和分子育種提供新的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材 料

以芥菜型油菜作圖群體親本紫葉芥作為構建BAC 文庫材料，提取植物幼葉總DNA，用Hind III不完全酶切，然后將酶切片段插入改良過的pIndigoBAC536 克隆載體構建芥菜型油菜BAC 文庫即ZBjH 文庫。ZBjH 文庫包含71 808（384×187）個BAC 克隆，經用I-sceI 酶切后用脈沖場分離檢測，插入片段大小在50～190 kb 之間，平均插入片段大小為126.7 kb，空載率2.7%，相當于芥菜型油菜1 068 Mb 基因組的8.7 倍。ZBjH BAC 文庫由華中農業大學羅美中教授實驗室協助構建。

1.2 方 法

主要用PCR 篩選法，利用遺傳圖的SSR 引物篩庫，篩到的BACs 進行末端測序，然后將BAC 末端設計引物，篩選具有共同的核苷酸序列的BACs，對應于同一遺傳位點的不同克隆必然擁有相同的核苷酸序列，表明它們的插入片段存在重疊區域，根據這一原理組建重疊群。

1.2.1 BAC 混合池構建 建立了3 個水平的BAC DNA 池（一級池、二級池和三級池）。一個三級池由一個平板的一行48 個克隆的DNA 組成（如34 號平板的AB，CD……OP）；一個二級池由一個平板（含有384 個克隆）的DNA 組成；一個一級池由連續10 個的二級池的DNA 混合而成（如1～10，11～20……181～187），共19 個一級池。

1.2.2 BAC 混合池篩選 用PCR 技術進行油菜BAC DNA 文庫(含187 個平板，每個平板含384 個克隆)的篩選分4 步進行。BAC DNA 文庫篩選的第一步是對19 個一級池的篩選；得到陽性一級池后(如18 號一級池)，對其所含的10 個二級池（從171～180）進行第二步篩選；得到陽性二級池后，對其所含的8 個三級級池（如171 號的AB，CD，EF，GH，IJ，KL，MN，OP）進行第三步篩選；得到陽性三級池后，對48 個克隆進行菌落PCR（第四輪）篩選，得到單一陽性克隆。

1.2.3 測 序 將菌落PCR 篩選，得到的單一陽性克隆搖菌過夜，由華大基因公司測BAC 末端序列。

1.2.4 BAC 末端引物設計和文庫再篩選 得到的BAC 末端序列用軟件Primer Premier 5.0 設計BAC末端引物，BAC 末端引物命名方法是：BAC 的CMR/M13 端引物為BAC-L，而S1 端引物為BACR。用新設計的末端引物繼續篩選ZBjH BAC 文庫。

1.2.5 BAC 末端序列BLAST 分析 得到的BAC末端序列在http://brassicadb.org 上進行序列比對，構建BAC 重疊群。

2 結果與分析

2.1 BAC 重疊群的構建

從遺傳定位研究中發現的共分離標記A9-88和A9-32 開始進行ZBjH BAC 文庫篩選，A9-88 篩選到63-H-13、102-C-7、160-C-4、152-E-22、85-O-7 和110-H-12 等BACs，而A9-32 篩選到160-C-4 和31-O-21 2 個BACs。兩個標記均篩選到BAC 160-C-4，測BAC 末端序列，通過設計BAC末端引物160C4L/R 繼續篩選BAC 文庫，向兩端進行延伸。

試驗共篩選出BAC752 個，末端測序395 個，得到BAC 末端序列674 條，設計BAC 末端引物533 對，構建了芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區域長約2.2 Mb 的BAC 重疊群，見圖1。

圖1 芥菜型油菜黃籽基因區域種子BAC 重疊群

此種子BAC 重疊群，左起BAC 末端標記124J24R，右至BAC 末端標記171J1L，圖1 展示26個BAC 和64 個標記，其中SSR 標記10 個，BAC 末端標記49 個，根據白菜序列設計的STS 標記5 個。

有的標記本該篩選到BAC，卻未能篩選到，如標記122I23L 未能篩選到BAC 68-D-18，但通過測序BAC 68-D-18，將其全長序列與標記122I23L 的序列進行比對，發現能比對上，說明BAC 68-D-18上有一段序列與標記122I23L 相同，應該可以被篩選到。出現這種情況的可能原因有：①建BAC DNA四級池時，由于提取高純度的質粒DNA 難度較大，有的BAC 質粒DNA 濃度較低，PCR 篩選時未篩選到。②PCR 技術的原因，PCR 分4 步進行篩選時，可能漏篩。有的標記如184E24R 不能篩選到BAC 154-P-5，可能原因是：引物184E24R 是在重復區域設計的，能與多條序列比對上，因此，此標記不可靠，棄之。在圖中挑選這26 個種子BACs 構建重疊群時，遵循的原則有兩點：（1）盡可能多的標記能篩選到它；（2）標記序列不是重復序列。這樣出現假陽性BAC 克隆的幾率較小。

2.2 物理圖譜比較

根據BAC 末端序列與白菜序列的比對結果和白菜、甘藍型油菜轉錄組測序的結果，對白菜、甘藍型油菜、芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區域支架（Scaffolds）序列排序進行比較，見圖2。

圖2 芥菜型油菜與白菜型、甘藍型油菜物理圖譜比較

試驗中構建的BAC 重疊群，定位在芥菜型油菜A9 染色體標記A9-121到A9-351之間，涵蓋了Scaffold000040的一部分，Scaffold000185、Scaffold 000059、Scaffold0000169、Scaffold000135 和Scaff-old000102 的全部以及Scaffold000066的一部分，白菜A9染色體Scaffold000040、Scaffold000185、Scaffold000059、Scaffold0000169、Scaffold000135、Scaffold000102 及Scaffold000066 的長度分別為：1.87 Mb、207 kb、1.34 Mb、280 kb、460 kb、837 Kb及1.31 Mb，通過估算，研究構建的BAC重疊群約為2.2 Mb。

根據試驗結果，發現芥菜型油菜A9 染色體支架（Scaffolds）序列排序與白菜、甘藍型油菜都有不同，如圖2 所示：Bancroft 等[18]認為白菜該區域附近的支架排序是：從左至右依次是000040 號支架、000059 號支架、000066 號支架、000022 號支架，而甘藍型油菜在000040 號支架和000059 號支架之間正向插入了Scaffold000185 號支架，在000059 號支架和000066 號支架之間正向插入000135 號支架和反向插入000102 號支架，而筆者研究發現芥菜型油菜與白菜不同之處除了跟甘藍型油菜一樣正向插入000185 號支架和000135 號支架、反向插入000102 號支架外，還在000059 號支架和000135 號支架之間反向插入了約280 kb 的000169 號支架。這說明在芥菜型油菜進化過程中，A9 染色體序列也發生了插入、易位等結構重排，而且這種結構重排與甘藍型油菜并不完全相同。

3 結 論

構建了芥菜型油菜A9 染色體黃籽基因區域長約2.2 Mb 的BAC 重疊群，為PCR 步移篩選法構建BAC 重疊群建立了方法，同時發現芥菜型油菜該區域DNA 序列與白菜、甘藍型油菜都有較大差異。由于該區域可能處在著絲粒附近，序列高度重復，構建難度較大，要想將此重疊群向兩端繼續擴大，需綜合特異性探針的雜交、PCR 篩選、酶切指紋分析、BAC 克隆STC 延伸、BAC 末端測序等多種方法。

[1]劉忠松，王 卓，劉顯軍，等.2012 油菜A9 染色體的標記、基因和結構變異[EB/OL].http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/201203-55.

[2]Yang P, Shu C, Chen L, et al.Indentification of a major QTL for silique length and seed weight in oilseed rape（Brassica napus L.）[J].Theor Appl Genet, doi:10.1007/s00122-012-1833-7.2012.

[3]劉顯軍，袁謀志，官春云，等.芥菜型油菜黃籽性狀的遺傳、基因定位和起源探討[J].作物學報，2009，35（5）：839-847.

[4]Feng J, Long Y, Shi L, et al.Characterization of metabolite quantitative trait loci and metabolic etworks that control glucosinolate concentration in the seeds and leaves of Brassica napus[J].New Phytologist, 2012, 193: 96-108.

[5]Wang H, Wu J, Sun S, et al.Glucosinolate biosynthetic genes in Brassica rapa[J].Gene, 2011, 487: 135-142.

[6]Zhao J Y, Huang J X, Chen F, et al.Molecular mapping of Arabidopsis thaliana lipid-related orthologous genes in Brassica napus[J].Theoretical and Applied Genetics, 2012, 124: 407-421.

[7]Panjabi P, Jagannath A, Bisht N C, et al.Comparative mapping of Brassica juncea and Arabidopsis thaliana using Intron Polymorphism （IP） markers: homoeologous relationships,diversification and evolution of the A, B and C Brassica genomes[J].BMC Genomics, 2008, 9: 113-131.

[8]Li F, Kitashiba H, Inaba K, et al.A Brassica rapa linkage map of EST-based SNP markers for identification of candidate genes controlling flowering time and leaf morphological traits[J].DNA Research, 2009, 16: 311-323.

[9]Li X, Ramchiary N, Choi S R, et al.Development of a high density integrated reference genetic linkage map for the multinational Brassica rapa Genome Sequencing Project[J].Genome, 2010, 53:939-947.

[10]Ramchiary N, Nguyen1 V D, Li X, et al.Genic microsatellite markers in Brassica rapa: Development, characterization,mapping, and their utility in other cultivated and wild brassica relatives[J].DNA Research, 2011, 18: 305-320.

[11]Xu J, Qian X, Wang X, et al.Construction of an integrated genetic linkage map for the A genome of Brassica napus using SSR mark ers derived from sequenced BACs in B.rapa[J].BMC Genomics 2010, 11: 594.

[12]Wang J, Lydiate D J, Parkin I A P, et al.Integration of linkage maps for the Amphidiploid Brassica napus and comparative mapping with Arabidopsis and Brassica rapa[J].BMC Genomics,2011, 12: 101.

[13]Ding G, Liao Y, Yang M, et al.Development of gene-based markers from functional Arabidopsis thaliana genes involved in phosphor us homeostasis and mapping in Brassica napus[J].Euphytica, 2011, 181: 305-322.

[14]Wang Y, Sun S, Liu B, et al.A sequence-based genetic linkage map as a reference for Brassica rapa pseudochromosome assembly[J].BMC Genomics, 2011, 12: 239.

[15]Jiang C, Ramchiary N, Ma Y, et al.Structural and functional comparative mapping between the Brassica A genomes in allotetraploid Brassica napus and diploid Brassica rapa[J].Theor Appl Genet, 2011, 123: 927-941.

[16]Wang X W, Wang H Z, Wang J, et al.The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J].Nature Genetics,2011, 43: 1035-1039.

[17]Mun J H, Kwon S J, Yang T J, et al.The first generation of a BAC-based physical map of Brassica rapa[J].BMC Genomics,2008, 9: 280.

[18]Bancroft I, Morgan C, Fraser F, et al.Dissecting the genome of the polyploid crop oilseed rape by transcriptome sequencing[J].Nature Biotechnology, 2011, 29: 762-7.