更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞保護及 Bcl-2、Bax表達的影響

江 波，張端蓮

（1.湖北省武漢市三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430061；2.武漢大學基礎醫(yī)學院，武漢 430062）

更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞保護及 Bcl-2、Bax表達的影響

江 波1，張端蓮2

（1.湖北省武漢市三醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430061；2.武漢大學基礎醫(yī)學院，武漢 430062）

[目的]探討更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞保護作用的機制。[方法]選用鼠齡為11～15個月的自然更年期雌性SD大鼠，20只,隨機分為2組，即更年平調(diào)液組（P組）、更年期對照組（M組）。另選鼠齡為4～6個月的SD大鼠，10只，為青年對照組（Y組）。藥物干預第45天，采用免疫組織化學方法檢測各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達，利用計算機圖像分析技術(shù)測量各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達水平。[結(jié)果]更年平調(diào)液組Bcl－2、Bax的表達較更年期對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），更年平調(diào)液組與青年對照組比較Bcl－2、Bax的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。[結(jié)論]更年平調(diào)液能抑制心肌細胞凋亡而對心肌細胞起著重要的保護作用。

更年平調(diào)液；心肌；更年期大鼠；Bcl-2；Bax；凋亡；免疫組織化學

更年期綜合征是指更年期婦女卵巢功能逐漸衰退直至消失的一個過渡時期，由此引起的內(nèi)分泌失調(diào)和植物神經(jīng)功能紊亂是其主要證候，絕經(jīng)是其主要標志，臨床表現(xiàn)除月經(jīng)紊亂、眩暈耳鳴外，還有胸悶煩躁、心悸氣短、烘熱出汗、失眠多夢或精神抑郁等一系列癥狀群[1-2]。中醫(yī)學稱其為“絕經(jīng)前后諸癥”，多發(fā)于45～55歲婦女期，根據(jù)癥狀的不同亦可歸屬于“心悸”、“臟躁”、“失眠”、“崩漏”等范疇。

中醫(yī)認為：絕經(jīng)前后，婦女“七七”任脈虛衰，太沖脈衰，天癸竭，腎氣漸衰，肝腎功能不足，精血虧損，陰陽失調(diào)。因腎為先天之本，主藏精，主生長、發(fā)育與生殖。肝主要藏血,血化精。人體五臟六腑靠精血濡養(yǎng)，則身體健康。肝腎軾能虧損，精血不足，則表現(xiàn)諸證[3]。肝腎虛損，陰不制陽，肝陽上亢，則面赤烘熱,煩躁易怒。陰虛生熱則口苦、口干、多汗。腎陰虧損,則頭暈目眩、腰膝酸軟、失眠、多夢、記憶力減退。肝血不足,血不養(yǎng)筋脈,則關節(jié)疼痛,四肢麻木,陰陽失調(diào)。

更年期平調(diào)液經(jīng)長期大量臨床觀察研究證實能明顯改善更年期婦女的心血管癥狀，減慢心率，改善心室功能，但其作用機制尚未明確。

細胞凋亡是近年來的研究熱點之一,也是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),其中Bcl-2家族在細胞凋亡過程的作用的研究備受重視，Bcl-2和Bax是該家族中的重要成員,兩者主要通過線粒體途徑參與凋亡過程，當細胞受到各種刺激信號,與Bcl-2相結(jié)合的Bax就會被置換出來,線粒體膜通透性增加,釋放出一系列物質(zhì),最終導致細胞死亡[4-5]。研究認為Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax的比值對于決定細胞接受死亡刺激信號后存活與否起關鍵性作用[6]。

本研究采用免疫組織化學方法，觀察了更年期平調(diào)液對更年期大鼠心肌組織內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax的表達水平，探討更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌保護作用的可能機制，以期為臨床運用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 更年平調(diào)液組（P組，n=10）：SD大鼠，雌性，鼠齡為11～15個月，經(jīng)陰道細胞涂片證實屬更年期，給予更年平調(diào)液組干預，為治療組。更年期對照組（M組，n＝10）：大鼠選取同更年平調(diào)液組，給與生理鹽水，為陰性對照組。青年對照組（Y組，n＝10）：SD大鼠，鼠齡為4～6個月，雌性。

各組處理方案：P組按照20mL/kg體質(zhì)量給與更年平調(diào)液灌胃，每日1次,連續(xù)45d；M組按照20mL/kg體質(zhì)量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)45d；Y組處理方法同M組。最后1次灌胃后24h，麻醉取心肌組織做免疫組織化檢測。

1.2 實驗用藥 更年平調(diào)液由枸杞子、肉蓯蓉、制何首烏、女貞子及龍齒等12味中藥組成,由武漢大學中南醫(yī)院中藥房配制（廣州濟光制藥,批號900803）。

1.3 主要試劑和儀器 濃縮型兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型S-P通用型免疫組織化學試劑盒（福州邁新公司）；YWY781型醫(yī)用微波儀（浙江臨安電子器材廠）；家用高壓鍋。

1.4 實驗方法 將各組藥物干預的大鼠麻醉處死，取臟，切成小方塊用10%甲醛固定，組織切片，常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗；3%過氧化氫，常溫孵育10min，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗4次，每次5min；10%正常山羊血清（PBS稀釋）室溫孵育10min，去血清，勿洗；滴加一抗37℃孵育1.5h，PBS洗4次，每次5min；滴加生物素標記的二抗工作液，37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；滴加辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液37℃孵育20min，PBS洗4次，每次5min；DAB顯色液顯色，自來水充分沖洗；蘇木精復染，脫水，透明，封片。

1.5 結(jié)果判斷 心肌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為抗體標記的Bcl-2、Bax陽性反應，對Bcl-2、Bax表達陽性的切片進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的視野（×400），用軟件檢測每個視野下陽性反應面積和所有細胞總面積，根據(jù)各組陽性表達情況分別計算陽性面積率（陽性面積率＝單位面積中陽性反應總面積/單位面積中細胞的總面積× 100%）。

1.6 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2的表達 更年平調(diào)液組心肌細胞胞漿內(nèi)可見深棕黃色密集顆粒，說明Bcl-2呈強陽性表達（見圖1）；更年期對照組心肌細胞胞漿內(nèi)無明顯棕黃色顆粒，說明Bcl-2無表達（見圖2）；青年對照組心肌細胞胞漿內(nèi)可見淡黃色顆粒密集，Bcl-2呈陽性表達（見圖3），較更年平調(diào)液組稍弱。分析結(jié)果經(jīng)q檢驗，更年平調(diào)液組與更年期對照組Bcl-2的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)，更年平調(diào)液組與青年對照組比較Bcl-2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表1。

表1 更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞Bcl-2表達的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

表1 更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞Bcl-2表達的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.1 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on the average OD and rate of positive area in expression of Bcl-2 in myocardial cell of rats with climacteric（±s）

注：更年平調(diào)液組與更年期對照組比較，*P＜0.01；更年期對照組與青年對照組比較，#P＜0.01。

組別 n 平均吸光度（A值） 陽性面積率（%）更年平調(diào)液組（P組） 10 0.4037±0.0613* 33.42±6.42更年期對照組（M組） 10 0.1041±0.0063# 10.13±5.40#青年對照組（Y組） 10 0.4086±0.0594## 33.32±5.07##

2.2 Bax的表達 更年平調(diào)液組心肌細胞胞漿內(nèi)未見明顯的棕黃色顆粒，Bax呈低表達（見圖4）；更年期對照組心肌細胞胞漿內(nèi)可見棕黃色密集顆粒，Bax呈陽性表達（見圖5）；青年對照組心肌細胞胞漿內(nèi)未見棕黃色，Bax無表達（見圖6）。圖像分析結(jié)果。

經(jīng)q檢驗，更年平調(diào)液組與更年期對照組比較Bax的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），更年平調(diào)液組與青年對照組比較Bax的表達異性無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表2。

表2 更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞Bax的表達的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

表2 更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞Bax的表達的平均吸光度和陽性面積率（±s）Tab.2 Effect of Gengnian Pingtiao liquid on OD and the rate of positive area in expression of Bax in myocardial cell in rats with climacteric（±s）

注：更年平調(diào)液組與更年期對照組比較，*P＜0.01。更年期對照組與青年對照組比較，#P＜0.01。

組別 n 平均吸光度（A值） 陽性面積率（%）更年平調(diào)液組（P組） 10 0.1171±0.0504* 19.14±5.26更年期對照組（M組） 10 0.3271±0.0173# 41.06±14.68#青年對照組（Y組） 10 0.1163±0.0534## 17.32±4.79##

3 討論

婦女更年期是指月經(jīng)完全停止前數(shù)月或數(shù)年至絕經(jīng)后若干年的一段時間,在月經(jīng)將絕未絕的1～2 a間，部分婦女將會出現(xiàn)植物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等紊亂為主的臨床癥狀群，主要表現(xiàn)為陣發(fā)性烘熱出汗、盜汗、煩躁易怒、頭暈目眩、憂郁、精神萎靡等癥狀，這些統(tǒng)稱為更年期綜合征[7]。在此時期，部分婦女由于雌激素減少引起骨質(zhì)疏松以及因植物神經(jīng)功能紊亂而出現(xiàn)胸悶、心悸氣短等心血管系統(tǒng)癥狀[8-9]。

中醫(yī)學認為，更年期綜合征是女子七七天癸竭，腎氣衰，月經(jīng)將閉，腎氣漸衰，沖任虛損，精血不足，調(diào)節(jié)陰陽相對平衡的機能失常，辨證施治,予以補腎法療法[10]，同時還認為腎為元陰元陽，腎在下焦，屬水，心在上焦，屬火，腎中之陰上升至心，則能涵養(yǎng)心陰，心中之陽下降至腎，能溫養(yǎng)腎陽，對于更年期綜合征的患者，予以補腎藥的同時給與歸心、肝的藥，可以平衡陰陽，調(diào)節(jié)沖任。

細胞凋亡，是各種細胞在一定條件下，通過啟動其自身內(nèi)部機制，引起內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生細胞的自然死亡[11]。細胞凋亡的過程是一種多種因子參與調(diào)節(jié)的過程，其中研究認為bcl-2家族被認為是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關鍵基因，bcl-2家族包含兩種功能調(diào)控基因：以bcl-2為代表的抑制凋亡基因和以Bax為代表的促進凋亡基因，Bax蛋白具有對抗Bcl-2，抑制細胞凋亡的能力。

Bcl-2基因最早是從濾泡性B細胞淋巴瘤中分離出來的一種原癌基因[12]，Vaux等[13]首先發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因能延長細胞的存活時間，后有諸多研究顯示Bcl-2基因可抑制多種組織細胞的凋亡，故稱其為凋亡抑制基因。Bcl-2主要存在于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，Bcl-2蛋白羧基端的跨膜區(qū)域?qū)cl-2蛋白發(fā)揮抑制凋亡功能起決定性作用。其機制可能是：1）Bcl-2蛋白位于線粒體上，通過抑制氧自由基的產(chǎn)生或起一種抗氧化劑的作用，而產(chǎn)生抗凋亡作用[14]。2）細胞凋亡中DNA的消化需要相關的Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶參與，Bcl-2通過阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放實現(xiàn)對細胞凋亡的抑制[15]。3）細胞凋亡時伴有細胞內(nèi)細胞色素C減少及線粒體內(nèi)細胞色素C增加，而Bcl-2主要定位于線粒體上，Bcl-2可能通過影響線粒體釋放細胞色素C的過程來調(diào)節(jié)凋亡[16]。Bax是Bcl-2家族中的一個重要成員，其與Bcl-2有21%的同源性，由192個氨基酸組成，其C-端含有疏水氨基酸組成的跨膜區(qū)域[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族成員蛋白共同點是在蛋白鏈上都存在3個結(jié)構(gòu)基序，分別稱為BH1、BH2和BH3結(jié)構(gòu)域[19]。Bcl-2和Bax的突變分析表明，保守的BH結(jié)構(gòu)域是蛋白具有異源或同源二聚體形成的關鍵區(qū)域。同時研究認為Bcl-2與Bax比例決定了細胞在受到凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡，若Bcl-2和Bax表達量平衡，形成的Bcl-2/Bax異源二聚體占優(yōu)勢，若Bcl-2過度表達而Bax表達不相應增多,會使細胞凋亡趨勢減弱，而細胞存活期延長；若Bax過表達，而Bcl-2表達不相應增多，則誘發(fā)凋亡，Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素,Bcl-2和Bax共同協(xié)調(diào)從而調(diào)節(jié)細胞凋亡[20]，因此Bax與Bcl-2的比值決定了細胞對凋亡刺激的敏感性，由此構(gòu)成一個新的調(diào)定點[21]。檢測這兩類蛋白的變化，就能多方面的了解凋亡信號在細胞內(nèi)所引起的變化。

本實驗用更年平調(diào)液給更年期大鼠灌胃，經(jīng)免疫組織化學方法顯示，更年平調(diào)液組心肌細胞Bcl-2呈強陽性表達，Bax無表達，表明Bcl-2具有抗心肌細胞凋亡的作用。更年期對照組心肌細胞Bcl-2無表達，Bax呈強陽性表達，表明該組心肌有發(fā)生凋亡的趨勢。青年對照組心肌細胞Bcl-2呈強陽性表達，Bax無表達，這可能是尚存活的心肌的一種自我保護機制。結(jié)果還提示Bcl-2在更年平調(diào)液組的表達高于更年期對照組，Bax在更年期對照組的表達高于更年平調(diào)液組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在更年平調(diào)液組，Bcl-2表達占優(yōu)勢，Bax低表達，可以形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚體和少量Bcl-2/Bax異源二聚體，而這兩種二聚體存在時起抑制細胞凋亡，維持細胞存活的作用。而Bax在更年期對照組表達增高，致使Bcl-2表達的減少，在更年期對照組Bax表達占優(yōu)勢，形成Bax/Bax同源二聚體增多，誘發(fā)細胞凋亡。Bcl-2的表達和Bax的過度表達在人心肌缺血保護或促進心肌細胞凋亡過程中可能具有重要的病理生理作用。Bax蛋白與Bcl-2蛋白共同調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡。

實驗結(jié)果說明更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞有保護作用。更年期平調(diào)液經(jīng)多年臨床應用已證實能明顯改善更年期婦女的心血管癥狀。中醫(yī)學認為：心為火，腎為水，水火相濟，心腎功能才可以維持平衡，因此可用補腎法來調(diào)節(jié)心臟功能。更年平調(diào)液中肉蓯蓉、枸杞子、女貞子和制何首烏具有補益肝腎、調(diào)節(jié)沖任的功效，龍齒平肝潛陽,鎮(zhèn)靜安神，諸藥合用使肝腎之陰得補，陽亢得抑，其目的是使“陰平陽秘”，以平為度。更年平調(diào)液對更年期大鼠心肌細胞的作用是能減少凋亡細胞數(shù)，增加成活細胞數(shù)，對心肌細胞起了重要的保護作用。

4 結(jié)論

更年平調(diào)液能抑制心肌細胞凋亡，對心肌細胞起著重要的保護作用。

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Effect of Gengnian Pingtiao liquid on expression of Bcl-2 and Bax in myocardial cell of rats with climacteric

JIANG Bo1,ZHANG Duan-lian2
（1.Department of TCM,The Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430061,China; 2.Basic Medical College of Wuhan University,Wuhan 430062,China）

[Objective]To explore of protective effects of Gengnian Pingtiao liquid on myocardial cell of rats with Climacteric.[Methods]The 20 SD rats of 11 to 15 months old with the natural climacteric were randomly divided into two groups:Gengnian Pingtiao liquid group (group P),menopause control group (group M).Another 10 SD rats,4～6 month old were taken for young control group (group Y).After experiment for 45 days,the average optical density(OD)and the rate of positive area of expression of Bcl-2 and Bax were analyzed by image analysis with HPIAS-2000 analysis system.[Results]The expression of Bcl-2 in group P was significantly higher than that in group M(P<0.01).No significant difference of expression of Bcl-2 was found between the group P and that in group Y(P＞0.05). The expression of Bax in group P was significantly lower than that in group M(P<0.01).No significant difference was found in the expression of Bax between group P and that in group Y(P＞0.05).[Conclusion]Gengnian Pingtiao liquid can inhibit the myocardial cell apoptosis and plays an important protective role for myocardial cell.

Gengnian Pingtiao liquid;cardiac muscle;menopause rats;Bcl-2;Bax;apoptosis;immunohistochemistry

R285.5

A

1672-1519（2012）04-0367-05

2012-02-13）

江 波（1968-），女，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療老年病。