當歸多糖對輻射損傷小鼠造血系統保護作用的研究＊

何曉莉，張 雁，吳 宏，姜 蓉

（重慶醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室／干細胞與組織工程研究室 400016）

當歸多糖對輻射損傷小鼠造血系統保護作用的研究＊

何曉莉，張 雁，吳 宏△，姜 蓉

（重慶醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室／干細胞與組織工程研究室 400016）

目的研究當歸多糖（APS）對電離輻射引起小鼠骨髓損傷的影響，旨在闡明APS對輻射性造血損傷的保護作用。方法采用直線加速器一次性4.0Gy劑量全身均勻照射C57BL／6小鼠，建立小鼠放射損傷動物模型。取外周血并進行常規檢測，提取骨髓單個核細胞（BMNC）并計數；骨髓切片染色觀察骨髓造血細胞數量改變；流式細胞術檢測細胞周期，細胞凋亡率；免疫細胞化學法檢測p53的表達。結果與對照組相比，生理鹽水（NS）組外周血白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）及BMNC計數均明顯減少，骨髓腔內造血組織顯著減少，BMNC G0／G1期比例、凋亡率、p53表達均升高；2mg／kg APS組和8mg／kg APS組均能提高外周血WBC、RBC、PLT及BMNC計數，增加骨髓腔內造血細胞數量，降低G0／G1期細胞比例以及細胞凋亡率。結論APS可以促進骨髓造血系統恢復，對輻射損傷具有良好的保護作用。

輻射損傷；造血系統；細胞周期；細胞凋亡；當歸多糖

當歸被廣泛應用在中藥的復方和驗方中，當歸多糖（angelica polysaccharides，APS）是當歸的主要生物活性物質［1］，近年來對APS成分和藥理學研究有了新的進展，發現其對機體免疫系統、造血系統有明顯作用以及抗腫瘤、抗放射性損傷的良好療效［2］。本文主要探討APS在造血系統抗輻射損傷方面的作用，旨在為其作為輻射保護劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 采用健康清潔級C57BL／6小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自重慶醫科大學動物實驗中心。實驗過程中對動物的處理符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的標準。主要試劑與設備，APS（產地：甘肅岷縣）由重慶醫科大學化學教研室分離、提純（純度大于950mg／g）。人淋巴細胞分離液（TBD公司）。蘇木素－伊紅（HE）染色試劑盒，Annexin V－FITC／PI檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；抗小鼠P53抗體（碧云天生物技術研究所進口分裝）。免疫染色試劑盒、DAB顯色試劑（北京中山金橋生物技術有限公司）。超凈工作臺、倒置顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 分組處理 小鼠隨機分為4組，對照組（注射生理鹽水，共18只）；生理鹽水（NS）組、2mg／kg APS組和8mg／kg APS組（后3組各54只），共計180只。后3組小鼠采用直線加速器全身均勻照射，總劑量4.0Gy［3］，時間1.25min，X射線吸收劑量率為3.76Gy／min，焦點距小鼠100cm，面積25cm×25cm［4］。照射后約3h內腹腔分別注射 NS、2mg／kg APS和8mg／kg APS，每天0.2毫升／次，連續注射7d后眼眶取血并處死小鼠，取其骨髓［5］。

1.2.2 外周血檢測指標計數 常規方法進行白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）計數并取出骨髓。采用Ficoll－Hypague密度梯度離心法（密度：1.077±0.002），2 000r／min離心20min后獲取骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclearcell，BMNC），制成懸液，按 WBC計數方法進行計數。

表1 4組小鼠外周血細胞和BMNC的比較（±s，n＝6）

表1 4組小鼠外周血細胞和BMNC的比較（±s，n＝6）

★：P＜0.05，與對照組比較；▲：P＜0.05，與NS組比較。

組別 WBC（×109／L） RBC（×1012／L） PLT（×109／L） BMNC（×106／股骨）對照組 7.05±0.87 10.84±1.67 1 203.33±256.62 3.69±0.75 NS組 1.54±0.13★ 7.47±0.32★ 287.76±79.65★ 0.86±0.19★2mg／kg APS組 1.87±0.19★ 8.68±0.61★▲ 318.08±96.01★ 1.91±0.13★▲8mg／kg APS組 3.41±0.07★▲ 9.59±0.43★▲ 623.08±187.91★▲ 2.75±0.17★▲

1.2.3 觀察放射后小鼠骨髓的病理學改變 采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出一側股骨，經取材、固定、洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、脫蠟復水、HE染色、封片后，顯微鏡下觀察骨髓病理學改變［6］。

1.2.4 BMNC細胞周期的測定 收集BMNC，70%冰乙醇4℃固定過夜；經磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，再加入100μL牛胰核糖核酸酶（1mg／mL）；37℃水浴箱中孵育30min，加入碘化丙啶染色液（50μg／mL），避光反應30min，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件（日本Phenix公司）分析。

1.2.5 BMNC凋亡率的檢測 收集BMNC，PBS洗滌細胞2次，用1×binding緩沖液調整細胞濃度約為1×106／mL；取100μL樣品，再加入5μL Annexin V－FITC和5μL碘化丙啶（PI）；混勻細胞，25℃暗室孵育15min；每份樣品加入1×binding緩沖液100μL后流式細胞儀檢測；利用FCM雙參數分析區分出凋亡細胞并計算凋亡率。

1.2.6 BMNC p53蛋白的免疫細胞化學檢測 收集BMNC，制成細胞懸液。4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次每次5min；按免疫染色及DAB顯色試劑盒說明書進行染色、顯色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，p53陽性細胞核呈棕褐色，陰性細胞不著色。隨機選擇5個視野（×400），每個視野計數100個細胞，計算p53陽性率＝p53陽性細胞數／100×100%。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 APS對放射損傷小鼠外周血的影響 照射后第7天NS組與對照組相比，全血各系及BMNC計數全面下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；2mg／kg APS組小鼠外周血 WBC、RBC和PLT及BMNC與NS組相比，各項指標均有所升高，僅RBC和BMNC計數差異有統計學意義（P＜0.05）；8mg／kg APS組與NS組相比，升高更明顯，差異均有統計學意義（P＜0.05）；外周血各項指標及BMNC計數至第7天仍低于正常水平，見表1。

2.2 APS對放射損傷小鼠骨髓的影響 照射后第7天NS組與對照組相比，骨髓腔內造血組織顯著減少；而2mg／kg APS組與NS組相比，造血組織有所增加；8mg／kg APS組與NS組相比，造血組織明顯增加；2mg／kg APS組與8mg／kg APS組相比，后者骨髓腔內造血組織多于前者，但至照射后第7天，各照射組骨髓造血面積仍未恢復至正常水平，見圖1。

2.3 APS對放射損傷小鼠BMNC細胞周期的影響 照射后第7天NS組BMNC停滯于G0／G1期，與對照組比較顯著均有統計學意義（P＜0.05）；隨時間變化，G0／G1期細胞比例呈由高到低的變化，到第7天時仍未恢復正常。2mg／kg APS組和8mg／kg APS組與NS組比較，其G0／G1期比例均下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 4組小鼠BMNC細胞周期、凋亡率以及p53表達陽性率的比較（±s，n＝6）

表2 4組小鼠BMNC細胞周期、凋亡率以及p53表達陽性率的比較（±s，n＝6）

★：P＜0.05，與對照組比較；▲：P＜0.05，與NS組比較。

組別 G0／G1期（%） 凋亡率（%） p53表達陽性率（%對照組）55.82±2.84 5.53±1.85 0.00 NS組 75.23±10.69★ 12.37±1.26★ 23.39±4.34★2mg／kg APS組 63.17±6.01★▲ 7.25±0.93★▲ 22.45±4.27★8mg／kg APS組 64.65±4.17★▲ 6.24±0.79★▲ 22.57±1.97★

2.4 APS對放射損傷小鼠BMNC凋亡率的影響 照射后第7天NS組BMNC的凋亡率均較正常組顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；2mg／kg APS組和8mg／kg APS組與 NS組相比，凋亡率均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；但仍高于對照組水平，見表2。

2.5 APS對放射損傷小鼠BMNC p53表達陽性率的影響對照組小鼠BMNC不表達p53，NS組、2mg／kg APS組和8 mg／kg APS組均有表達，且與對照組相比，p53的表達率升高明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2，封4圖2。

3 討 論

骨髓是機體對電離輻射高度敏感器官之一，也是機體的主要造血器官。電離輻射對造血系統的損傷主要表現為造血功能的破壞和抑制，而造血功能障礙主要表現為全血細胞減少［7］。本研究結果顯示，與對照組相比，NS組 WBC、RBC、PLT及BMNC計數顯著降低。HE染色結果顯示，與對照組相比，NS組骨髓腔內造血組織面積明顯減小，造血細胞數量減少。

APS有明顯的抗輻射作用，主要表現在促進機體造血功能恢復，增加血細胞含量［8－11］。本研究結果還顯示，與NS組相比，兩種劑量APS組WBC、RBC、PLT及BMNC計數均上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。HE染色結果顯示，兩種劑量APS組骨髓腔內的造血組織面積均明顯增大，造血細胞數量增多。證明APS可促進電離輻射引起的造血系統損傷的恢復，與以往文獻報道一致。

國內外大量研究表明，電離輻射不僅可以加速細胞衰老，還可以誘導細胞凋亡［12］。p53基因既參與細胞周期停滯，還與細胞凋亡密切相關［13］。野生型p53基因半衰期短，免疫細胞化學方法檢測不到其表達，故本研究檢測突變型p53基因的表達。本研究結果顯示，p53基因在對照組不表達，照射組表達率顯著升高，但各APS組和NS組比較差異不明顯，這可能是由于突變型p53基因的表達不會因為損傷得到修復而減少所致。細胞周期和凋亡率檢測結果顯示，NS組與對照組相比，G0／G1期比例和凋亡率均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），各APS組與NS組比較，G0／G1期比例和凋亡率均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明電離輻射可以誘導細胞凋亡，APS可以促進細胞周期阻滯及凋亡的恢復。

目前，放療是腫瘤的主要治療方式，它在殺死腫瘤細胞的同時也損傷機體正常細胞，因此，輻射保護劑的開發勢在必行。大量文獻報道APS有明顯的抗輻射、抗腫瘤等作用，但其具體機制仍不清楚，本研究就APS抗電離輻射的機制進行基礎研究，為后續研究提供參考依據。

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Studys of angelica polysaccharides on the protection of ionizing radiation in injured mice＊

He Xiaoli，Zhang Yan，Wu Hong△，Jiang Rong
（Department of Histology and Embryology，Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering，Faculty of Basic Medical Sciences，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo study the effects of angelica polysaccharide（APS）on the damage of bone marrow by ionizing radiation in injured mice，so as to illuminate the protective effects of APS against radioactive haematogenesis injury.MethodsUsing the linear accelerator irradiate C57BL／6mice one time with 4.0Gy X ray to establish the animal radiation injured model.Then these mice were killed and extracted BMNC after 7days injection.Counting the number of the blood cells and BMNCs and observing the pathology change of bone marrow.The cell cycle and apoptosis rate were detected by flow cytometry and the expression of p53was detected by immunocytochemistry.ResultsCompared with normal group，the percentage of G0／G1phase，apoptosis rate and the expression of p53increased significantly，while the number of the blood cells and BMNCs，the number of cells in bone marrow obviously decreased in NS group；both in the 2mg／kg APS and 8mg／kg APS group，the percentage of G0／G1phase and apoptosis rate decreased，while t he number of the blood cells and BMNCs，the number of cells in bone marrow increased.ConclusionAPS can improve the fuction of bone marrow hematopoietic system and have protection in ionizing radiation.

radiation injuries；hematopoietic system；cell cycles；apoptosis；angelica polysaccharide

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.019

A

1671－8348（2012）35－3734－03

重慶市渝中區科技計劃項目（20110321）。 △

，Tel：13368080808；E－mail：wuhong6368＠126.com。

2012－06－13

2012－09－12）

·調查報告·