RP-HPLC法同時測定四季三黃片中5種指標成分

張海紅，王樹，張丹參，薛貴平

(河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

RP-HPLC法同時測定四季三黃片中5種指標成分

張海紅，王樹，張丹參，薛貴平

(河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

目的建立RP－HPLC法同時測定四季三黃片(大黃、黃芩、梔子、黃柏)中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的方法。方法采用Thermo－C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流動相為甲醇－0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫，檢測波長分別為240 nm、345 nm、278 nm、254 nm;體積流量1.0 mL/min。結果梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為:6～60 μg/mL、5.4～54 μg/mL、5.3～53 μg/mL、4.3～43 μg/mL、5.8～58 μg/mL(0.999 7＜r＜0.999 9)，平均回收率在98.0%和102%之間。結論該法檢測效率高，專屬性強，重復性好，可用于四季三黃片中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的定量測定。

RP－HPLC;四季三黃片;梔子苷;鹽酸小檗堿;黃芩苷;大黃素;大黃酚

四季三黃片是由大黃、黃芩、梔子、黃柏加工而成的中藥復方制劑，具有消炎退熱、通便利水功效，用于治療口鼻生瘡、咽疼牙痛、口干舌燥、目眩頭暈、大便秘結、小便赤黃［1］。有報道［2－7］測定了其中的某一種或兩種成分，也有采用薄層色譜等方法控制其質量的報道［8－9］，但同時測定四季三黃片中5種成分的方法尚未見報道。根據中醫理論，復方中藥藥效的發揮是各藥味多種組分共同作用的結果，它們含有量的多少及比例關系會影響其療效［10－11］，使用HPLC同時測定藥物中多種有效成分的方法也受到了越來越多的關注［12］。為了更好的控制四季三黃片的內在質量，保證臨床用藥的安全、有效，本實驗以梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚作為四季三黃片的質控指標，采用多波長RP－HPLC法對5個成分進行同時測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters600高效液相色譜儀，Empower化學工作站，2996 DAD檢測器(美國waters公司);KS—6000超聲波清洗機(寧波科生儀器廠)。

1.2 試藥梔子苷(110749－200714)、黃芩苷(110715－200212)、鹽酸小檗堿(110713－200911)、大黃素(110756－200110)和大黃酚(110796－200310)均購于中國藥品生物制品檢定所;四季三黃片(江西華太藥業，批號090623，090712，100722);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Thermo－C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流動相為A甲醇－B 0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序為0～5 min(40%A，直線)，5～10 min(60%A，線性)，10～20 min(80%A，線性)，20～35 min(90%A，線性)，35～45 min(90%A，直線);檢測波長為240 nm(梔子苷)、345 nm(鹽酸小檗堿)、278 nm(黃芩苷)、254 nm(大黃素和大黃酚);體積流量1.0 mL/min，進樣量20 μL。在該條件下樣品中各待測組分分離度符合要求(R＞1.5)，梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的保留時間分別約為7.9、14.8、18.0、36.9、40.1 min。混合對照品溶液、樣品溶液及各陰性對照溶液HPLC圖見圖1～4。

圖1 240 nm處的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms at 240 nm

2.2 混合對照品溶液及供試品溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備精密稱取梔子苷6.0 mg、鹽酸小檗堿5.4 mg、黃芩苷5.3 mg、大黃素4.3 mg和大黃酚5.8 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚質量濃度分別為120、108、106、86、116 μg/mL，作為混合對照品貯備液，精密量取上述貯備液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻線，搖勻，制成質量濃度分別為24、21.6、21.2、17.2、23.2 μg/mL的梔子苷、鹽酸

圖2 345 nm處的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms at 345 nm

圖3 278 nm處的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms at 278 nm

2.2.2 供試品溶液的制備取四季三黃片10片，去包衣后研細，取細粉約0.3 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，加入25mL甲醇，稱定質量，50℃超聲30 min取出，放冷，稱質量，加甲醇補足減失質量，濾過，取濾液2 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻線，搖勻作為供試品溶液。

2.3 精密度試驗取2.2項下混合對照品溶液，在2.1項色譜條件下重復進樣5次，記錄峰面積，計算梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的色譜峰面積，其RSD值分別為1.2%、0.8%、0.9%、1.0%、1.3%(n=5)，結果表明精密度良好。

2.4 重復性試驗取同一批四季三黃片(批號090712)5份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下平行測定，計算含有量，梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚含有量的RSD值分別為1.4%、1.1%、0.9%、1.2%、1.2%，表明方法的重復性良好。

2.5 穩定性試驗取同一樣品溶液在12 h內間隔2 h進樣測定，記錄峰面積，計算梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚色譜峰的峰面積的RSD值分別為1.3%、1.0%、0.9%、1.4%、小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚混合對照品溶液。1.7%(n=5)，表明樣品溶液在12 h內穩定。

圖4 254 nm 處的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms at 254 nm

2.6 線性試驗精密量取2.2項下的混合對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度制成系列質量濃度的溶液，在2.1項色譜條件下測定，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標(C)，峰面積為縱坐標(A)，進行線性回歸，結果見表1。

表1 5種指標成分的線性關系Tab.1 Regression equations of five compositions

2.7 加樣回收率試驗取已知梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚含有量的同一批樣品(批號090712)6份，每份約0.1g，精密稱定后置25mL量瓶中，各加入混合對照品貯備液2 mL，甲醇定容至刻度，濾過，按2.1項下的方法進樣，測定含有量，計算回收率。結果梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的平均回收率分別為98.2%，98.0%，102%，101%，99.7%，RSD分別為1.4%，1.0%，1.7%，0.8%，1.0%(n=6)，符合要求。

2.8 樣品測定取四季三黃片10片，去包衣后研細，取細粉約0.3 g，按照2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下的方法進樣測定，每份樣品測3次，測定3批樣品，代入回歸方程計算各成分質量分數，結果見表2。

表2 四季三黃片樣品測定結果(n=3)Tab.2 Results of assay for different batches of Siji Sanhuang Tablets(n=3)

3 討論

3.1 四季三黃片中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚5種指標成分最大吸收波長不同，經全自動紫外可見分光光度計檢測梔子苷的最大吸收波長為240 nm，鹽酸小檗堿的最大吸收波長為345 nm，黃芩苷的最大吸收波長為278 nm，大黃素和大黃酚的最大吸收波長為254 nm附近有較強吸收，為保證各指標成分都有較好的靈敏度并減少干擾，實驗中選用多波長法，使不同化合物在各自最大吸收波長下測定，以獲得最佳的檢測效果。

3.2 文獻報道［2－8］四季三黃片的定量測定方法很多，但在同一色譜條件下實現梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚5種組分同時定量測定的方法尚未見報道，本實驗采用梯度洗脫，可一次進樣同時檢測上述5種成分，檢測效率高，且精密度、重復性等方法學考察均符合要求，該法可用于四季三黃片的質量控制。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準:中藥成方制劑第二十冊［S］.1998:67.

［2］馮看，楊黎.HPLC測定四季三黃片中大黃素和大黃酚的含量［J］.廣西中醫學院學報，2008，11(2):50－52.

［3］許江紅，張若良.HPLC法測定四季三黃片中黃芩苷的含量［J］.江西中醫學院學報，2006，18(6):12.

［4］黃淑彰.RP－HPLC法測定四季三黃片中梔子苷的含量［J］.廣西中醫藥，2004，27(4):53－54.

［5］吳曉勇，許江紅，張若良.高效液相色譜法測定四季三黃片中鹽酸小檗堿含量［J］.中國藥業，2010，19(16):32

［6］彭文，劉兆雄.四季三黃片中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的同時測定［J］.中國藥業，2011，20(17):35－36

［7］鄔曉鷗，毛筑梅，肖麗和，等.多波長高效液相色譜法測定四季三黃膠囊中4種主藥成分含量［J］.天津藥學，2004，16(3):5－8

［8］宋文煥.四季三黃片和四季三黃丸薄層色譜分析［J］.中國中藥雜志，2002，27(9):713

［9］卞艷晶，高延甲，王建.四季三黃片質量控制方法的研究［J］.齊魯藥事，2010，29(1):20－22

［10］李艷榮，蔣曄，郝福，等.RP－HPLC快速測定清胃黃連片中4種指標成分的含量［J］.中國中藥雜志，2007，32(24):2597－2600

［11］李艷榮，蔣曄，郝福，等.RP－HPLC同時測定功勞去火片中梔子苷、黃芩苷及鹽酸小檗堿的含量［J］.中成藥，2006，28(8):1126－1129

［12］祝忠民，盧曉榮.HPLC法同時測定三黃片中4種成分的含量［J］.西北藥學雜志，2008，23(5):300－301

Determination of five components in Siji Sanhuang Tablets by RP-HPLC

ZHANG Hai－hong，WANG Shu，ZHANG Dan－shen，XUE Gui－ping
(Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

AIMTo establish a method for simultaneously determining geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol in Siji Sanhuang Tablets(Rhei Radix et Rhizoma，Scutellariae Radix，Gardeniae Fructus，Phellodendri Chinensis Cortex).METHODSThe separation was performed on a thermo－C18column(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)with gradient elution using methanol and water(contained 0.1%H3PO4)as mobile phase.The detection wavelengths were 240 nm，345 nm，278 nm and 254 nm，respectively.RESULTSLinear ranges of geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol concentrations were 6－60μg/mL，5.4－54 μg/mL，5.3－53 μg/mL，4.3－43 μg/mL，5.8－58 μg/mL(0.999 7＜r＜0.999 9)，respectively.Their average recoveries fell between 98.0%and 102%.CONCLUSIONThe RP－HPLC method established in this experiment can be used to determine the contents of geniposide，berberine hydrochloride，baicalin，emodin and chrysophanol in Siji Sanhuang Tablets.The method can also be used as the standard for the quality control of Siji Sanhuang Tablets.

RP－HPLC;Siji Sanhuang Tablets;geniposide;berberine hydrochloride;baicalin;emodin;chrysophanol

R927.2

A

1001－1528(2012)10－1915－04

2012－01－20

張家口市科學技術研究與發展指導計劃項目(1021097D)

張海紅(1981—)，女，講師，碩士，研究方向:中藥藥代動力學。E－mail:zhanghaihongzhh@163.com