苦蕎麥總黃酮含量測(cè)定方法研究

施明毅，李建利,2，張繼斌，毛瓊麗

苦蕎麥Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn為蓼科蕎麥屬植物，作為一種重要的小宗雜糧作物和藥食同源植物，在我國(guó)東北、西北、西南地區(qū)均有分布；其根及根莖為中藥苦蕎頭的來源，收錄于《中華本草》[1]。現(xiàn)代研究表明[2~6]，苦蕎麥中主要有效成分為黃酮類化合物，其籽粒、根、莖、葉及花中均含有較多主要糧食作物所缺乏或不具有的黃酮等藥用成分，具有降血糖、降血脂，抗氧化和清除自由基等多種生理活性，對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、中風(fēng)等有一定的預(yù)防和輔助治療效果。勁牌有限公司技術(shù)中心旨在苦蕎酒降血糖、降血脂、降血壓方面的保健功能開發(fā)，因此，探索苦蕎麥提取工藝條件并制定準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法是很有必要的。本研究采用紫外-可見分光光度法，建立總黃酮含量測(cè)定方法，為苦蕎酒的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DJ600-2型電子天平（成都倍塞克儀器表研究所）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KQ5200型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100080-200707)；苦蕎麥(勁牌有限公司技術(shù)中心提供，經(jīng)考證為蓼科植物苦蕎麥 Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn的果實(shí)部分)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)法優(yōu)選苦蕎麥提取工藝條件

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[2,6~8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，以苦蕎麥總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取溶媒用量、溶媒種類、提取次數(shù)和提取時(shí)間等主要影響因素為考察因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。因素、水平及試驗(yàn)結(jié)果見表1～表3。

表1 總黃酮提取工藝因素水平表

表2 總黃酮提取的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 總黃酮提取方差分析表

結(jié)果表明，影響總黃酮提取率的各因素作用的大小是B＞D＞C＞A，且B和D因素有極顯著性差異，C因素有顯著性差異，A因素沒有顯著性差異，且水平A1和A2差異不大。綜合考慮提高總黃酮提取率和降低工業(yè)生產(chǎn)成本的要求，確定最佳提取工藝條件為A1B3C2D3，即100倍量甲醇，提取2次，每次2 h。3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

2.2 苦蕎麥總黃酮含量測(cè)定方法研究

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品適量(4.99 mg)，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加適量30%乙醇超聲使其溶解，放冷后用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得0.0998 mg﹒mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品粗粉0.5 g，置于燒瓶中，按正交試驗(yàn)優(yōu)選所得工藝條件進(jìn)行制備，即加甲醇50 mL，加熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，用甲醇定容至100 mL，搖勻，即得。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 將蘆丁對(duì)照品溶液在200 nm～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示在510 nm處有最大吸收，故選擇該波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.4 測(cè)定方法 取1 mL供試品溶液置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，放置6 min后加入0.3 mL l0% Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6 min后加入2 mL 1 mol﹒L-1NaOH溶液，搖勻，放置15 min后用30%乙醇定容，搖勻。用紫外-可見分光光度計(jì)在510 nm處分別測(cè)定吸光度，試劑為空白。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取0.5，1，2，3，4，5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于10 mL容量瓶中，照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度A。以濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：A=0.01154c-0.00431，r=0.9998。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品在0.0499 mg～0.4990 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液2 mL，照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度A，并連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果吸光度平均值為0.2349，RSD為0.14%，見表4。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液(0.0998 mg﹒mL-1)2 mL和苦蕎麥供試品溶液1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度A，于0、15、30、45、60、90 min后各測(cè)1次。結(jié)果RSD分別為0.35% 和0.91%，見表5。結(jié)果表明，對(duì)照品和供試品在90 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取苦蕎麥粗粉0.5g，共5份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下制備，并照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸收度A，并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為4.03%，RSD為0.98%，見表6。結(jié)果表明，采用該方法提取與檢測(cè)，重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(4.03%)的苦蕎麥粗粉0.1 g，共5份，各加入46 mL甲醇，再準(zhǔn)確加入4 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為0.9196 mg﹒mL-1)加熱回流提取，其作法同“2.2.2”項(xiàng)下，照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸收度A，并計(jì)算含量。結(jié)果平均回收率為100.98%，RSD為2.15%，見表7。結(jié)果表明，供試品溶液的制備及測(cè)定方法合理可行。

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 小結(jié)與討論

3.1 苦蕎麥?zhǔn)俏覈?guó)一種傳統(tǒng)的農(nóng)作物，其種植歷史悠久，具有一定的藥用和保健作用，是我國(guó)藥食同源文化的典型體現(xiàn)，亦是國(guó)際糧農(nóng)組織公認(rèn)的優(yōu)秀糧藥兼用之良種。近年來，苦蕎麥作為保健食品原料進(jìn)行開發(fā)，已開發(fā)出苦蕎麥掛面、苦蕎麥快餐粥、苦蕎維夫餅干、苦蕎麥麥片、苦蕎麥沖劑、苦蕎茶等多種產(chǎn)品。目前市場(chǎng)上以苦蕎作為原料開發(fā)的白酒亦不在少數(shù)，具有良好的接受基礎(chǔ)和市場(chǎng)基礎(chǔ)。苦蕎的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)與運(yùn)用，前景看好。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，按優(yōu)選工藝條件提取的苦蕎麥總黃酮含量高達(dá)4.03%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的1.97%~3.03%[6]。紫外-可見分光光度法具操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本研究?jī)?yōu)選所得提取工藝條件穩(wěn)定可行；建立的含量測(cè)定方法穩(wěn)定性好，合理、可行，可為苦蕎酒的開發(fā)提供參考依據(jù)。

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