注射用鹿茸多肽生物活性測定方法研究

李麗靜，劉少麗，徐 博，劉 佳，王楚盈，吳世佳，張 松

(長春中醫藥大學，長春 130117)

生物活性檢定是檢定藥品質量的重要檢驗方法之一，中藥是天然環境條件中產生的生物制品，具有成分復雜、可變因素多、活性成分多、作用靶點多、藥效成分和毒性成分不清晰等特點。因此，中藥質量標準僅用理化方法測定指標成分有一定的局限性，而通過生物活性檢定方法可測定與臨床相關的生物學活性，正適用于中藥這樣具有多種相似生物活性成分的藥品。注射用鹿茸多肽為新鮮或冷凍的鹿茸中提取的骨肽溶液制成的無菌凍干品，輔料為甘露醇，性狀為白色或類白色塊狀物。藥理學表明，注射用鹿茸多肽有明顯的促進骨生長作用［1-3］。為更好地控制其生物活性以便指導臨床用藥，本課題嘗試體外培養成骨細胞，采用新生大鼠頭蓋骨成骨細胞和成骨樣細胞株-人骨肉瘤細胞MG-63進行該藥生物學活性檢測標準的研究，結果如下。

1 材料

1.1 動物

新生24h內健康SD大鼠，吉林大學實驗動物中心提供(合格證號為SCXK－(吉)2007-0003)。

1.2 細胞株

成骨樣細胞株-人骨肉瘤細胞MG-63購于中國協和醫科大學基礎醫學院細胞中心，生長于含10%胎牛血清的含必需氨基酸的DMEM中，常規傳代培養。

1.3 藥品

注射用鹿茸多肽樣品(批號110608，25mg)由本課題組自制。

1.4 試劑

Ⅰ型膠原酶(協和醫科大學基礎醫學院細胞中心);必須氨基酸(協和醫科大學基礎醫學院細胞中心);胰蛋白酶(Sigma公司)青霉素和鏈霉素(Hyclone);L-谷氨酰胺(Sigma);二甲基亞砜(DMSO，Sigma);胎牛血清(Hyclone公司產品)噻唑藍(MTT，Sigma);DMEM固體培養基(GIBCO公司產品);胰蛋白酶消化液-EDTA(協和醫科大學基礎醫學院細胞中心);其他試劑為國產分析純。

1.5 儀器

離心機(LD4-2A，上海安亭)，酶標儀(Model-680，美國伯樂公司)，倒置顯微鏡(CKX41，日本奧林巴斯)，二氧化碳培養箱(MCO-175，日本三洋);分析天平(AL-204，Metter-Thermo Group)，生物安全柜(305040195，France Thermo)，超純水機(Human up 900，韓國 Human)。

2 方法

2.1 試劑與藥液的配制

2.1.1 MTT溶液的配制 稱取250mgMTT放入小燒杯中，加50mL PBS(0.01mol/L，pH7.2)在電磁力攪拌機上攪拌30min，用0.22μm的微孔過濾器除菌分裝，4℃保存。

2.1.2 藥液的配制 注射用鹿茸多肽臨用前用高糖 DMEM培養基配制，0.22μ微孔濾膜除菌后，給藥時用高糖DMEM培養基稀釋至所需濃度，作為供試品使用。

2.2 細胞培養方法

2.2.1 人成骨樣細胞株MG-63的培養與傳代人成骨樣細胞株MG-63生長于含10%胎牛血清維生素 C(50mg/L)，L-谷氨酸(300mg/L)的DMEM培養液中，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代，在37℃ 5%CO2條件下常規方法培養。

2.2.2 大鼠乳鼠成骨細胞的分離、培養與傳代采用Ⅰ型膠原酶梯度培養法進行新生大鼠頭蓋骨成骨細胞的培養［4、5］，將 24h 內出生的 Wistar乳鼠10只直接浸泡于75%酒精中消毒15min，取出放入平皿中。無菌條件下操作取其頭蓋骨，放入裝有4℃預冷的PBS液(含100U/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素)的培養皿中，剔除頭蓋骨骨膜及周圍軟組織，用PBS液清洗后，剪碎至1mm×1mm小片，再用 PBS液沖洗2次。將洗凈的骨組織移入0.25%胰蛋白酶中37℃下消化20min，以消化清除纖維組織，棄掉上清液再將骨片移入0.1%Ⅰ型膠原酶中，37℃下消化60min，用含血清的培養液終止消化，同樣操作重復2次，合并2次的Ⅰ型膠原酶消化液，離心棄掉上清液，加入細胞培養液清洗后吹打均勻成細胞懸液，計數并以終濃度1×106個/mL接種于25mL培養瓶中(預置消毒玻片，以便于鑒定細胞)。在37℃ 5%CO2、飽和濕度恒定條件下培養，隔日觀察、換液。細胞長成致密單層鋪滿培養瓶底，即可進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化使貼壁細胞松解，輕搖培養瓶細胞即可從培養瓶底部脫落下來，以終濃度1×104個/mL接種于新培養瓶內進行傳代培養，以此法培養至第3代細胞可用于進行實驗。

2.3 細胞形態學觀察

細胞接種于25mL培養瓶中，每日于倒置顯微鏡下觀察培養中的細胞形態及生長情況。細胞在倒置顯微鏡下觀察貼壁前形態完整，呈均勻一致的球型，4h內細胞貼壁，細胞形態主要有長梭形、三角型、多角形，形態相似的細胞成堆出現，可呈簇生長。

圖1顯示，MG-63細胞比較大而豐滿，更大更寬厚一些，生長速度比較快，一般3d即能長滿單層;大鼠原代培養的頭蓋骨成骨細胞較小且狹長，鏡下顏色比較淺，第1代生長比較緩慢，大概7d～10d長成單層，傳代后生長速度比加快而且比較穩定。但總體形態相似，從形態上保留了成骨細胞的特征。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(×10)

2.4 注射用鹿茸多肽促成骨細胞增殖的活性驗證及活性檢測用細胞的選擇

2.4.1 注射用鹿茸多肽對體外培養新生大鼠頭蓋骨成骨細胞增殖的影響 表1顯示，成骨細胞分離、培養與傳代方法同2.2.2。待細胞生長至60%～70%貼壁后，用0.25%胰蛋白酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM培養液吹打制成細胞懸液，第2代細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至3×104，接種到96孔細胞培養板，每孔100μL，其中10孔加含10%胎牛血清的 DMEM培養液(不含細胞)100μL作為對照，置37℃ 5%C02培養箱培養 12h。棄去培養液供試品組，用DMEM培養基稀釋樣品至 1.0mg/ml、0.25mg/ml、0.01mg/ml，每孔加入 200μL，每批供試品做 10孔，細胞對照組和空白對照組每孔分別加入DMEM培養基 200μL，置 37℃ 5%C02培養箱培養 72h，結束培養前4h取出細胞培養板吸取培養液，每孔加入0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.3)洗滌1次，然后每孔加入上述緩沖液(pH7.3)配制的 MTT［6］溶液30μL，繼續培養4h。培養結束后，吸棄孔內 MTT溶液，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩培養10min，在酶標儀用590nm波長處測定其吸光度OD值。

2.4.2 注射用鹿茸多肽對體外培養成骨樣細胞MG-63增殖的影響 用含10%的胎牛血清DMEM培養液常規培養MG-63細胞，0.25%胰蛋白酶的消化液消化傳代培養，培養至第3代，消化后收集到的細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至3×104，接種到96孔細胞培養板。給藥濃度、分組、培養時間同2.4.1。表2顯示，72h后在酶標儀用590nm波長處測定其吸收度OD值，比較各樣品與細胞對照間的統計學差異。

表1 注射用鹿茸多肽對體外培養成骨細胞增殖的影響(72h，n=10，x珋±s)

表2 注射用鹿茸多肽對體外培養MG-63細胞增殖的影響(72h，n=10，±s)

表2 注射用鹿茸多肽對體外培養MG-63細胞增殖的影響(72h，n=10，±s)

注:與細胞對照組比較:＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

組 別 給藥劑量 OD值細胞對照 200μL培養液0.175±0.032高 劑 量 1.00mg/ml 0.256 ±0.028＊＊中 劑 量 0.25mg/ml 0.250 ±0.023＊＊低 劑 量 0.01mg/ml 0.208±0.026*

2.4.3 活性檢測細胞的選擇 通過實驗結果可知，注射用鹿茸多肽對原代培養的大鼠頭蓋骨成骨細胞和MG-63細胞均具有促增殖作用，由于MG-63細胞株穩定、細胞間個體差異小、來源清楚、培養條件穩定、培養更方便，故采用 MG-63細胞作為活性檢測的細胞株進行實驗。

2.5 注射用鹿茸多肽活性檢測細胞密度優化

表3顯示，用含10%的胎牛血清的DMEM培養液調整 MG-63細胞密度至 5 ×103、5 ×104、5 ×105，分別接種到96孔細胞培養板，培養72h得出不同細胞濃度下的吸光度OD值。

表3 不同密度MG-63細胞的生長情況(72h，n=10，±s)

表3 不同密度MG-63細胞的生長情況(72h，n=10，±s)

細胞密度 OD值5×1030.154±0.030 5×104 0.387±0.031 5×1051.576±0.048

通過數據分析可得出細胞濃度不同，其吸光度值也不同，5×103細胞密度過低，細胞生長緩慢，OD值偏低;5×105細胞密度過大，3d已經長滿單層抑制細胞生長且OD較大，其中細胞密度為5×104時，細胞生長狀態良好，數據穩定。考慮到MTT檢測的線性范圍和加入注射用鹿茸多肽后的作用時間，所以選用此濃度范圍的5×104為細胞實驗密度。

2.6 注射用鹿茸多肽活性檢測給藥濃度及培養時間的篩選

細胞按5×104個/孔接種到96孔培養板上，分別與不同濃度的注射用鹿茸多肽培養基和正常DMEM-aa 培養基共同培養 12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h。實驗組和對照組分別取10個培養孔，在各時間點小心吸棄培養液，用 PBS洗滌1次，每孔加30μL MTT(5mg/ml)，繼續孵育 4h后終止培養。吸棄上清，每孔再加入150μL DMSO振蕩培養10 min。表4顯示，在酶標儀用590nm波長處測定其吸收度OD值，取其均值。圖2顯示，以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

表4顯示，接種后所測得的細胞剛接種后12h、24h、48hOD值變化不大，到第3天～第6天細胞OD值逐漸增加。12h、24h、48hOD值變化不大，甚至OD值下降，分析原因可能由于消化和傳代導致部分細胞受損傷死亡，使細胞數目減少，但48h～72h開始細胞數目逐漸增加。進入到對數增長期，考慮到一般細胞培養3d需要換液才能維持培養基的PH值及營養，為方便實驗操作，選擇72h為最佳測定時間。

表4 不同濃度注射用鹿茸多肽作用于MG-63細胞的生長情況(n=10，±s)

表4 不同濃度注射用鹿茸多肽作用于MG-63細胞的生長情況(n=10，±s)

注:與細胞對照組比較:＊＊P ＜0.01，*P ＜0.05

藥物濃度(mg/ml)12h 24h(1d) 48h(2d) 72h(3d) 96h(4d) 120h(5d) 144h(6d)2.50 0.116±0.022＊＊ 0.082±0.013* 0.082±0.025＊＊ 0.218±0.033＊＊ 0.305±0.021* 0.721±0.057 0.909±0.042*0.042 0.253±0.026 0.680±0.033 0.827±0.040 1.00 0.105±0.024＊＊ 0.096±0.026＊＊ 0.099±0.035＊＊ 0.242±0.031＊＊ 0.351±0.021＊＊ 0.799±0.042＊＊ 1.030±0.062＊＊0.50 0.101±0.032＊＊ 0.091±0.022＊＊ 0.092±0.036＊＊ 0.227±0.051＊＊ 0.370±0.049＊＊ 0.825±0.072＊＊ 1.019±0.078 0.25 0.103±0.033＊＊ 0.083±0.022* 0.095±0.041＊＊ 0.251±0.027＊＊ 0.397±0.042＊＊ 0.774±0.039＊＊ 0.975±0.055＊＊0.10 0.102±0.037＊＊ 0.056±0.042* 0.073±0.026* 0.258±0.048＊＊ 0.384±0.044＊＊ 0.837±0.059＊＊ 1.021±0.048＊＊0.01 0.090±0.012* 0.056±0.022 0.077±0.027＊＊ 0.198±0.036* 0.334±0.062＊＊ 0.768±0.056＊＊ 0.797±0.054對照組 0.073±0.047 0.066±0.031 0.059±0.024 0.160±

圖2 不同濃度骨肽注射液作用于MG-63細胞的生長情況

圖2顯示，0.1mg/ml劑量對細胞促增殖作用較好，因此選擇0.1mg/ml、72h為最佳刺激濃度和最佳測定時間。

2.7 注射用鹿茸多肽活性檢測重現性實驗

表5顯示，細胞生長對數期，消化、調整細胞密度為5×104個/孔接種至96孔板，置37℃ 5%CO2培養箱培養。待細胞貼壁4h后給注射用鹿茸多肽，培養72h后進行MTT檢測。對110608供試品不同時間重復試驗5次。

表5 注射用鹿茸多肽對MG-63細胞增殖的影響(72h，±s，n=10)

表5 注射用鹿茸多肽對MG-63細胞增殖的影響(72h，±s，n=10)

注:與細胞對照組比較:*P＜0.05，RSD值=11.50%

對照組 注射用鹿茸多肽OD值第1次 0.249±0.027 0.302±0.032*第2次 0.256±0.036 0.306±0.033*第3次 0.254±0.037 0.310±0.041*第4次 0.254±0.038 0.309±0.029*第5次 0.248±0.036 0.303±0.041*

通過以上數據可知，該方法重復性好，準確性高，可以作為注射用鹿茸多肽生物學活性的常規檢查方法。

3 討論

采用Ⅰ型膠原酶梯度培養法分離新生乳鼠頭蓋骨成骨細胞，得到的成骨細胞純度高、成活率高，且此法操作簡單，可以作為新生乳鼠頭蓋骨成骨細胞的常規培養方法。細胞生長密度大小對實驗結果有很大影響，密度過大會導致細胞在一定時間內成簇疊加生長，密度足夠大時會抑制細胞生長導致細胞死亡，密度過低細胞生長緩慢，MTT檢測時吸光度值偏低，影響評價藥物作用。藥物濃度較大，細胞生長速率較快，細胞數目足夠多時會導致細胞死亡;藥物濃度較低，細胞生長緩慢，MTT檢測時吸光度值偏低，所以給藥濃度較低或密度較低均會影響評價藥物作用。細胞生長可分為滯留期、對數期、生長停止期3個階段，給藥培養時間過長，使細胞達到生長停止期甚至死亡，MTT檢測吸光度值明顯偏低;給藥培養時間過短，未達到對數期則同樣會使MTT檢測吸光度值偏低，影響評價藥物作用。

目前在中藥注射劑質量標準中安全性檢查項目均采用生物檢定，而中藥生物活性或生物效價測定項目卻寥寥無幾，雖有人工察香、水蛙等中藥使用了生物活性測定法，但絕大多數中藥制劑主要使用理化分析方法。近年來，基于歐美藥品管理部門認為，草藥的質量穩定性單靠測定已知的有效成分是不夠的，因為草藥及其制劑是以其整體作為有效物質。因此，中藥的指紋圖譜檢測方法的推廣，使中藥質量控制從單一指標成分分析向綜合成分分析的方向發展。但脫離成分的有效活性和安全活性來考慮指標成分含量測定或多種成分的指紋圖譜檢測方法，雖然分析方法先進，但仍具有一定的局限性。因此，國內外基本上都將指紋圖譜的研究和應用限定在鑒別范疇，而采用生物檢定的方法與主要活性成分理化分析方法相結合的中藥質量標準，更能全面綜合地保證藥品的安全性、有效性和質量可控性。本課題以中藥鹿茸制成的注射用鹿茸多肽為研究對象，初步探討了應用主要藥效學指標作為生物活性檢測方法的可行性。通過實驗表明，可以選擇合適的中藥主要藥效學試驗方法，開展生物活性測定方法和測定限值的研究。

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