益生菌脫基因毒性作用的研究進展

文 / 孫二娜 張 昊 郭慧媛 任發政

（中國農業大學教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室）

1 前言

基因毒性是指能直接或間接損傷DNA的性質，包括對基因組的毒性作用引起的致突變性及其他不同效應[1]。具有基因毒性的物質可以直接或間接引起遺傳物質突變。人體長期暴露于基因毒性物質當中易增加患癌癥的風險。自然界中存在多種基因毒性物質，如致癌芳香烴、苯并芘、致癌芳香胺、亞硝酸化合物、黃曲霉毒素等。這些物質廣泛地存在于環境當中，人體無法完全避免與基因毒性物質的接觸。如果能有效降低基因毒性物質的毒性，就能降低癌癥發生的風險。

已有研究表明，一些益生菌在體外實驗中能夠降低一些基因毒性化合物的活性，例如亞硝胺、黃曲霉毒素、多環芳烴、雜環芳香胺等[2～6]，表明益生菌具有脫基因毒性的作用。但其脫毒機制尚不明確，具有脫基因毒性的菌株資源也比較匱乏。篩選具有脫基因毒性作用的益生菌并研究其脫基因毒性機制意義重大。

2 基因毒性的定義

具有基因毒性的物質可致突變，可使原癌基因發生改變。致突變作用是指化學物質引起生物的遺傳物質突然的根本變化，包括染色體畸變和基因突變。如果發生在生殖細胞上則可遺傳給下一代，如發生在體細胞中則不會遺傳給后代，只影響本身。體細胞突變是癌腫瘤形成的基礎，已知致癌物絕大部分都有致突變作用。突變和癌變可能是一個過程的兩個階段。致癌物先與DNA發生反應，造成細胞遺傳信息異常（突變），然后引起細胞癌變，形成癌腫。體外致突變性和體內致癌性有高度的相關性，致突變物的存在能導致對DNA無可挽救的損傷，從而導致癌癥的發生。

3 基因毒性物質

基因毒性化合物是指能直接或間接損傷細胞DNA，產生致突變或致癌作用的物質。N-亞硝基化合物、黃曲霉毒素、多環芳烴化合物、雜環胺類化合物是分布較廣的致癌物質[7]。在脫基因毒性實驗中常用的基因毒性物質主要有以下幾種：

3.1 4-硝基喹啉-1-氧化物

4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinolin 1-oxide）屬硝基芳烴，是一種很強的化學誘變劑和致癌物質。由于環境中多環芳烴化合物的不完全燃燒和氮的氧化，硝基芳烴在自然界中廣泛存在。許多硝基芳烴化合物能夠在細菌和哺乳動物細胞內誘導基因突變。

4-NQO并非直接致癌物質，它需要進一步的活化。在代謝活化過程中發生酶還原作用，4-羥基—氨基喹啉-1-氧化物（4-HAQO）經過進一步還原后，轉化為4-氨基喹啉-1-氧化物（4-AQO）[8]；研究表明，4-NQO和4-HAQO涂擦局部會誘發癌腫[9]，而4-AQO無毒。4-HAQO并非最終致癌物，仍須再次活化。這一活化過程可能是經過氨基酰基-tRNA合成酶的媒介作用，使氨基酸特別是絲氨酸與4-HQO結合，形成絲氨酸酯，然后再與鳥嘌呤或腺瞟呤結合，形成加成物[10]。另有研究觀察到，4-NQO還能以外附于DNA雙螺旋結構的方式與大分子呈非共價鍵結合，影響DNA的復制與轉錄等過程。最近的研究表明，經過4-NQO作用后，DNA的損傷可引起復制后修復[11]，由于復制后修復易形成堿基配對錯誤，可導致細胞突變或癌變，研究者認為這可作為體細胞突變學說的實驗根據。

3.2 甲基硝基亞硝基胍

甲基硝基亞硝基胍是強烈的直接致癌劑，其不依賴于酶的代謝作用，直接作用于胃腸道黏膜，尤其口服時對胃有較高的致癌特異性。它主要在DNA鏈的復制區引起GC-AT的轉化，即使在致死率很低的條件下也能對微生物產生高頻的突變[12]。它在pH值低于5.5的條件下會形成亞硝酸而使菌種發生誘變，在堿性條件下形成重氮甲烷，此時它的生物學效應是重氮甲烷對DNA的烷化作用而使菌種發生誘變。

3.3 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素B1具有很強的致癌作用，它可引起染色體畸變和DNA損傷[13]。動物實驗證明長期攝入低濃度的黃曲霉毒素或短期攝入高濃度的黃曲霉毒素后均可誘發肝癌，此外還可誘發胃癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌，卵巢及小腸等部位的腫瘤。人類流行病學調查發現，黃曲霉毒素與人類肝癌發病率呈正相關，且存在著劑量-反應關系。

4 脫基因毒性的主要研究方法

4.1 Ames實驗法

Ames實驗法是利用組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌突變株為測試指示菌，觀察其在受試物作用下回復突變為野生型的一種測試方法[17]。組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌在缺乏組氨酸的培養基上不能生長。但在加有致突變原的培養基上培養，則可使突變型產生回復突變成為野生型，即恢復合成組氨酸的能力，于是就能在缺乏組氨酸的培養基上生長為菌落，通過計數菌落出現的數目就可以估算受試物誘變性的強弱。

檢測系統中還包括大鼠的肝微粒體酶（S9）體外代謝活化系統，使受試物在體外受到與活體內類似的氧化活化作用，故可測出間接誘變原。

4.2 SOS顯色反應

SOS 反應是E.coli受到DNA 損傷時會誘導一系列功能，而這些功能總稱為SOS反應[14,15]。SOS 顯色反應中用的指示菌是基因工程菌E.coli PQ 37，有多個基因突變，uvrA 突變使菌體失去了剪切修復的能力，因此對DNA 損傷試劑更敏感。rfA 突變使菌體缺乏脂多糖，使受試化合物更易滲透進入細胞。E.coli PQ 37還帶有一個Sfi:Lacz融合基因，刪除了正常的lac基因，因此β-半乳糖苷酶的活性嚴格受SOS反應中與細胞分化抑制有關的sfiA基因操縱子的控制。指示菌暴露于基因毒性物質，即可產生SOS 反應，組成該反應系統的recA 蛋白即轉化為recA 蛋白水解酶。此酶可分解阻遏蛋白，受阻遏的sfiA 基因去阻遏，并啟動lacZ基因翻譯、轉錄、表達，其表達產物即為半乳糖苷酶。此酶可分解鄰硝基苯β-D-半乳糖苷（ONPG），產生黃色可溶性物質，根據其顏色的深淺可對被誘導酶的數量進行定量測定，從而判斷DNA 是否受損傷及受損傷的程度。可通過β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的誘導和堿性磷酸酶（組成型）的表達檢測指示菌的SOS應答活性，通過SOS誘導因子檢測樣品的基因毒性。

4.3 高效液相色譜（HPLC）檢測法

高效液相色譜是分析實驗室的常用分析儀器，在益生菌脫除基因毒性實驗中，采用高效液相色譜分析測定基因毒性是近年來一種新的研究方法。2007年，王芳等人進行了如下研究[19]：Lact . salivarius FDB89與4-NQO共培養后，利用SOS顯色反應法檢測唾液乳桿菌的脫基因毒性作用，同時采用高效液相色譜分析共培養前后的4-NQO含量變化。色譜分析條件為:C18反相色譜柱，以乙腈、水為流動相進行梯度洗脫，流速為 1 mL /min；檢測波長為 365 nm。結果表明 ，唾液乳桿菌轉化了4-NQO，降低了4- NQO的基因毒性，并且HPLC測定的結果與 SOS顯色反應測定的結果具有良好的一致性。

與HPLC的方法相比，Ames實驗與SOS顯色反應是利用短期細菌系統來檢測DNA 損傷，在分辨基因毒性物質和非基因毒性物質上高度敏感且特異性高。但是這兩種生化方法，在測定過程中會受到初始指示菌活性、濃度以及對毒性物質的最大耐受量等因素的影響，而且實驗步驟多，反應耗時，操作復雜，過程不易控制，實驗之間及不同實驗室之間結果誤差較大[16，17]。此外，SOS顯色反應是通過大腸桿菌的SOS反應誘導能力來間接表征待測化合物基因毒性大小的，將其應用在篩選脫基因毒性功能的益生菌時，只能反映基因毒性的相對減少量，不能反映益生菌發揮脫基因毒性的途徑，即不能區分脫基因毒性是源于菌體對毒性物質的吸附作用還是對毒性物質的轉化作用。另外，SOS顯色反應用到的指示菌PQ37是基因工程菌，目前只能通過贈送的方式獲得，使其廣泛應用受到了一定的限制。

在王芳等人的研究中，HPLC的結果表明[18]，唾液乳桿菌脫基因毒性作用伴隨著4- NQO峰面積的減少而增強，同時有新的產物峰出現。從HPLC結果可以看出，唾液乳桿菌的脫基因毒性作用是通過菌體對4-NQO的轉化作用實現的。HPLC法測定唾液乳桿菌的脫基因毒性精密度高，重復性好，并且可以區分脫基因毒性的作用過程。

5 益生菌脫除基因毒性的可能機理

一般認為，益生菌對致癌物的脫毒功能主要通過兩種途徑實現：一種是通過菌體對有毒物質的吸附來實現；另一種是通過菌體將有毒物質轉化為無毒物質的代謝過程來實現[19]。不同的菌株脫基因毒性的作用機制不盡相同。Renner等人用Ames實驗研究了益生菌對含硝基的牛肉抽提物的抗突變活性，結果發現所有檢測的菌株都有抗突變活性，主要是通過吸附作用降低其毒性[20]。在王芳等人的研究中，HPLC的檢測結果顯示，唾液乳桿菌脫基因毒性作用伴隨著4-NQO峰面積的減少而增強 ，同時有新的產物峰出現[18]，表明唾液乳桿菌的脫基因毒性作用是通過菌體對4-NQO的轉化作用實現的。

6 小結與展望

益生菌具有脫基因毒性的作用及潛在的抗癌功能，在癌癥的預防和輔助治療方面有很大的應用前景，但其機制還不十分清楚、菌種資源也較為匱乏。今后需利用體外脫基因毒性實驗篩選具有脫基因毒性功能的益生菌菌株，進一步研究其作用特征及作用機制，為脫基因毒性菌株的應用奠定良好的基礎。

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