高效液相色譜法測定酸奶和液體奶中對羥基苯甲酸酯類的研究

文 / 梁 艷 呂海燕 劉麗君 李翠枝 王艷萍 任新志 邵振國

（內蒙古伊利集團實業股份有限公司）

對羥基苯甲酸酯類，又稱尼泊金酯，因其低毒、非揮發性、良好的殺菌能力和穩定性，而被用作食品防腐劑。Routledge等[1]首次發現對羥基苯甲酸酯具有雌激素活性，對消費者的身心健康嚴重不利。衛生部規定了食品中對羥基苯甲酸酯類的添加限量[2]和醬油、醋、水果汁及果醬中對羥基苯甲酸酯類的測定方法[3]，也有一些地方標準規定了食品中對羥基苯甲酸酯類的測定方法，即高效液相色譜法[4]，但乳制品中對羥基苯甲酸酯類尚無國家衛生檢驗的標準測定方法。

鑒于此，本實驗建立了簡便、快速的酸奶和液體奶前處理方法，以及分析對羥基苯甲酸乙酯（EP）和對羥基苯甲酸丙酯（PP）的液相色譜法。該方法分離效果好，抗干擾能力強，且定量較準確，是檢測這兩種防腐劑的一種較為理想的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

配有紫外檢測器的高效液相色譜儀；超聲波；甲醇、無水乙醇，為色譜純；冰乙酸為優級純；對羥基苯甲酸酯類標準品：對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯，純度≥99%。

圖1 對羥基苯甲酸酯類標準品的高效液相色譜圖（標準品的濃度為10.0 μg/mL）

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：甲醇-水-乙酸（體積比為60∶40∶5）；檢測波長：256 nm。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準工作溶液的配制

將對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯用無水乙醇配成1.0 mg/mL的混標貯備液，按實際檢測要求，用無水乙醇稀釋到相應濃度的混合標準工作溶液，濃度系列為1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。1.3.2 樣品前處理

稱取約10 g（精確至0.1 mg）樣品于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲提取30 min，冷至室溫后用水定容。冷凍1 h后過濾，取濾液過0.2 μm的濾膜，上機測定。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的確定

對羥基苯甲酸酯類難溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機溶劑。本實驗分別選用乙醇、甲醇[5]作為提取溶劑進行回收率實驗。結果表明，用甲醇提取的回收率要遠高于用乙醇提取的回收率。因此，確定甲醇為對羥基苯甲酸酯類的提取溶劑。

2.2 柱子的選擇

本實驗分別選用150 mm和250 mm的柱子對對羥基苯甲酸酯類的混標進行分離，結果表明，150 mm的柱子和250 mm的柱子均可以將對羥基苯甲酸酯類的混標分開，但是在用150 mm的柱子進行分離時，兩種對羥基苯甲酸酯類的出峰時間較早，而且相隔很近。為了便于對樣品中的對羥基苯甲酸酯類進行很好地分離，本實驗采用250 mm的柱子進行分離。

表1 對羥基苯甲酸酯類的線性范圍、線性方程和檢出限

表2 酸奶和液體奶的添加回收率實驗結果

2.3 標準曲線的線性范圍

對羥基苯甲酸酯類的混合標準工作液用無水乙醇稀釋定容，配制對羥基苯甲酸酯類標準溶液的濃度系列分別為1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和40.0 μg/mL。對羥基苯甲酸酯類標準品通過高效液相色譜進行分析，檢測結果如圖1所示。結果表明，在甲醇-水-乙酸為流動相條件下，對羥基苯甲酸乙酯的出峰時間為5.42 min，對羥基苯甲酸丙酯的出峰時間為8.12 min，而且分離效果較好。

根據色譜圖中各組分的峰面積與其質量濃度進行回歸，得出回歸方程和相關系數，結果如表1所示，其中Y代表峰面積，X代表進樣的質量濃度（μg/mL）。由表1可知，對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯的濃度分別在1～40 μg/mL的線性范圍內時，線性關系良好。

2.4 回收率測定

本實驗對酸奶和液體奶中對羥基苯甲酸酯類的回收率進行了測定。在酸奶和液體奶樣品中分別加入1 mg/mL、1.8 mg/mL和10 mg/mL的對羥基苯甲酸酯類混合標準品進行測定，結果如表2所示。從表2可以看出，對羥基苯甲酸乙酯的回收率在97.2%～102%之間，對羥基苯甲酸丙酯的回收率在96.9%～102%之間，這說明該方法的加標回收率很好。

2.5 實際樣品的檢測

本實驗對酸奶和液體奶的20 批次樣品進行了檢測，這些樣品中均不含對羥基苯甲酸酯類，故對其進行了加標檢測，結果表明該方法的平行性良好，符合實驗要求。

3 結論

本方法以標準樣品的保留時間定性，外標法定量，進行了酸奶和液體奶中對羥基苯甲酸酯類含量的測定。采用該方法能夠準確定量測定酸奶和液體奶中對羥基苯甲酸酯類的含量，而且簡便、快速、靈敏，重現性較好。該方法不僅是測定酸奶和液體奶中對羥基苯甲酸酯類含量的有效方法，而且也可以為乳制品中其它防腐劑的分析測定奠定基礎。

[1] Parker J，Odum J，Ashby J，et al. Some atkylh benzoate preservatives（parabens）are estrogenic. Toxicolo Applied Pharmacology，1998，153（1）：12-19.

[2] GB 2760-2007 食品添加劑使用衛生標準.[3] GB/T 5009.31-2003 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定.

[4] DB37/T 1100-2008 食品中對羥基苯甲酸酯類的測定 高效液相色譜法.

[5] 陳皚，何喬桑，王萍亞，等. 固相萃取—高效液相色譜法測定水果和果醬中的6種對羥基苯甲酸酯. 色譜，2009，27（6）：804-808.