免疫固定電泳法檢測尿本－周蛋白的臨床應用

曾祝倫，張司蘭，熊 曼

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院檢驗科 400010；2.重慶市璧山縣人民醫院心血管內科 402760）

尿本－周蛋白（Bence－Jones protein，BJP）是監測漿細胞病和B淋巴細胞增殖性疾病的一個重要指標，其陽性結果與多發性骨髓瘤的發病密切相關。漿細胞惡性增殖時合成大量BJP，其實質是蛋白輕鏈合成紊亂。BJP大約由214個氨基酸組成，其結構與正常的免疫球蛋白輕鏈相同，有κ、λ輕鏈，具有特殊的熱沉淀性質。血清蛋白電泳、免疫球蛋白定量和熱沉淀反應等是臨床尿BJP檢測的主要方法［1］，由于上述方法的影響因素較多［2］，其特異性和靈敏度不理想，檢測效率低。本文采用免疫固定電泳檢測非濃縮尿中的BJP，以探討其臨床應用價值。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要試劑：2mol／L乙酸緩沖液、200g／L磺基水楊酸、尿蛋白電泳試劑盒（法國Sebia公司）及免疫固定電泳試劑盒（法國Sebia公司）。主要儀器：全自動電泳儀及掃描儀（法國Sebia公司）、AU560全自動生化分析儀（日本OLYMPUS公司）。

1.2 樣本 140例晨尿樣本均來自2004年5月至2008年4月重慶醫科大學附屬第二醫院的門診和住院患者，2～8℃保存，1周內集中檢測。其中多發性骨髓瘤26例，淋巴瘤白血病20例，粒細胞性白血病12例，腎病60例，骨髓移植2例，其他疾病20例。

1.3 免疫固定電泳及熱沉淀反應法檢測 蛋白質在pH 8.8巴比妥－巴比妥鈉緩沖液中電泳分離。將晨尿樣本進行免疫固定電泳和熱沉淀反應試驗。采用重鏈γ（IgG）、α（IgA）、μ（IgM），輕鏈κ、λ，游離輕鏈κ、λ等5種抗血清及蛋白固定液進行免疫固定，經蛋白固定液固定的條帶將顯示電泳后的蛋白質全貌，并將其作為參考泳道（electrophoresis，ELP）。用結晶紫對沉淀的蛋白進行染色，多余染料用酸性介質沖洗。將檢測結果進行掃描分析。熱沉淀反應法參照全國臨床檢驗操作規程進行試驗［3］。

2 結 果

2.1 BJP免疫固定電泳 采用Sebia全自動電泳儀對140例晨尿樣本進行十二烷基硫酸鈉－瓊脂糖凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate－agarose gel electrophoresis，SDS－AGE），76 例 存 在異常區帶，異常區帶的相對分子質量為25 000或50 000。將存在異常區帶的76例晨尿樣本進行BJP免疫固定電泳，發現有42例樣本中尿BJP陽性，其中IgGκ型BJP 26例，IgMλ型BJP 16例，見圖1。熱沉淀反應法檢測僅有24例為尿BJP陽性。

2.2 免疫固定電泳檢測的靈敏度 免疫固定電泳檢測出尿BJP陽性的尿蛋白濃度為20mg／L，當濃度達2 000mg／L時，未發現干擾；而熱沉淀反應法檢測出尿BJP陽性的尿蛋白濃度達320mg／L，在濃度為1 280mg／L時，即出現干擾。

2.3 尿蛋白電泳與BJP的關系 對76例尿蛋白SDS－AGE出現異常BJP區帶的樣本進行BJP免疫固定電泳。結果顯示，尿蛋白電泳出現異常BJP區帶的陽性率為55.3%（42／76），見表1。

2.4 免疫固定電泳檢測的效率 將76例尿蛋白SDS－AGE出現異常BJP區帶的樣本采用BJP免疫固定電泳和熱沉淀反應法分別檢測，結果顯示，免疫固定電泳檢測尿BJP陽性為42例（57.1%），熱沉淀反應法檢測尿BJP陽性為24例（31.6%），見表2。

圖1 非濃縮尿蛋白免疫固定電泳圖

表1 非濃縮尿蛋白電泳的效率［n（%）］

表2 BJP免疫固定電泳與熱沉淀反應法檢測的效率［n（%）］

3 討 論

BJP是一種單克隆游離免疫球蛋白輕鏈，具有特殊的熱沉淀性質，因此實驗室主要以熱沉淀反應法檢測尿BJP。本研究結果顯示采用熱沉淀反應法，尿BJP的檢出率僅為31.6%。由于該法檢測靈敏度低（尿蛋白濃度為320mg／L時顯示尿BJP陽性，而尿蛋白濃度為1 280mg／L即出現干擾），因此，將其用于BJP的過篩試驗存在較大的漏檢率。

由于機體某個克隆發生病變而分泌大量單一、均質的單克隆蛋白，又稱M蛋白。多發性骨髓瘤、Waldenstrom′s巨球蛋白血癥、白血病和淋巴細胞瘤等疾病均伴有單克隆B細胞的增殖，后者產生大量完整的免疫球蛋白分子和蛋白輕鏈［4］。在疾病初期，這些蛋白輕鏈（相對分子質量為25 000）被腎小球濾出后在腎小管分解代謝，使尿BJP常呈陰性。隨著腫瘤的增大，合成的自由輕鏈增多，并超過腎小管的重吸收能力，造成BJP在腎小管中與游離鈣結合、沉淀，在腎小球毛細血管中淤積，導致腎單位破壞、腎功能減退，出現蛋白尿、管型尿，甚至血尿。免疫固定電泳是一種靈敏度、特異性較高的分離及鑒定蛋白質的方法［5］。靶抗原在載體上電泳后，將抗血清直接作用于待檢蛋白，可對待檢樣本中的蛋白成分進行鑒別。同時，免疫固定電泳不僅可用于M蛋白的分型，還可對存在M蛋白的患者進行早期診斷，其靈敏度、特異性優于骨髓細胞檢查。由于多發性骨髓瘤患者的漿細胞呈點性增殖，骨髓細胞形態學檢查的病理取樣存在較大的不確定性［6］，往往要在患者中、晚期進行多部位、多次骨穿，且瘤細胞大小超過正常10.0%才可作出診斷，而免疫固定電泳可彌補這方面的不足［7］。本研究將樣本進行免疫固定電泳，ELP顯示電泳后的蛋白質全貌，其余5條泳道鑒定單克隆成分，通過他們與重鏈γ（IgG）、α（IgA）、μ（IgM），輕鏈κ、λ及游離輕鏈κ、λ這5種抗血清是否反應進行成分鑒別［8］。

本研究發現，出現異常區帶的樣本中BJP檢出陽性率為55.3%，仍有44.7%為假陽性，這與某些小分子蛋白（如α1球蛋白）也可出現該條帶有關。因此，SDS－AGE尿蛋白電泳只能作為篩選異常蛋白的方法，若出現異常電泳區帶，還需進一步采用免疫固定電泳檢測確認。采用免疫固定電泳檢測BJP，尿液樣本以收集24h尿或晨尿為佳，要提高電泳檢測的靈敏度可濃縮尿液。但尿液濃縮的方法目前尚有待標準化。本實驗采用非濃縮晨尿進行檢測，結果表明免疫固定電泳對非濃縮尿也具有良好的靈敏度和特異性，與Levinson和Keren［9］的報道一致。

利用非濃縮尿對BJP進行免疫固定電泳，可提高M蛋白病的臨床診斷率。目前，多發性骨髓瘤的發病呈明顯上升趨勢［10－12］，因此，加強這一領域的研究，將有助于 M 蛋白病的早期發現。

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