高效液相色譜法檢測水產品中的孔雀石綠

萬譯文 ，洪 波，曾春芳，劉 麗 ，肖 維 ，黃華偉

（1.農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心（長沙），湖南 長沙 410153；2.湖南省水產科學研究所，湖南 長沙 410153）

隨著人們對食品安全要求的提高和國際貿易的發展，世界各國對食品檢測的項目越來越多，對農藥殘留分析技術的靈敏度、特異性和快速性提出了更苛刻的要求。孔雀石綠是一種帶有金屬光澤綠色的結晶體，化學名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式（C23H25ClN2），易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈藍綠色。它可用來作殺菌劑、驅蟲劑，是藥物染料中抗菌效力較強的一類，屬于三苯甲烷類染料[1]。水產品中孔雀石綠的檢測方法主要采用高效液相色譜法[2]及液質聯用法[3-4]。目前國內檢測孔雀石綠通常采用液相色譜－紫外檢測器法（柱后衍生法）[5]，執行SC/T 3018-2004水產行業標準。此方法需要在色譜柱后連接二氧化鉛氧化柱，把無色孔雀石綠轉化成有色孔雀石綠，可以同時檢測水產品中有色孔雀石綠和無色孔雀石綠的含量。大部分檢測孔雀石綠采用國標GB/T 20361-2006，方法原理是將有色孔雀石綠經硼氫化鉀溶液還原為無色孔雀石綠，然后用液相色譜法熒光檢測器檢測，這個方法大大降低了檢測限，可以滿足對歐盟及日本出口的條件。因此，我們在采用國標實驗過程中將發現的問題進行了總結，并簡化了試驗步驟，節約了前處理時間，建立了高效液相色譜法檢測水產品中孔雀石綠及其代謝物無色孔雀石綠的方法。采用該方法能得到較高的回收率和較低的檢出限，在水產品痕量孔雀石綠的檢測中具有廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 試劑

孔雀石綠（分析純，含量≥99.5%，上海哈姆科技有限公司公司）；乙腈（色譜純，含量≥99.9%，美國TEDIA公司）；冰醋酸（優級純，含量≥99.5%，天津科密歐公司）；乙酸銨（分析純，含量≥98.0%，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心）；鹽酸羥氨（分析純，含量≥98.5%，湖南匯虹試劑有限公司）；對甲苯磺酸（分析純，含量≥99.0%，湖南匯虹試劑有限公司）；二氯甲烷（分析純，含量≥99.5%，湖南匯虹試劑有限公司）；二甘醇（分析純，99.0%，成都金山化工試劑廠）；酸性氧化鋁（分析純，100～200目，國藥集團化學試劑有限公司）。提取液：稱取鹽酸羥氨13.40 g，對甲苯磺酸0.84 g，乙酸銨0.48 g，混放入燒杯中用去離子水溶解，轉移到500 mL的容量瓶中，用冰醋酸調節pH至4.5，定容。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜配RF-0AXL熒光檢測器（日本島津）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮化儀器廠）；高速冷凍離心機（德國HEMEL公司）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；電子天平（島津國際貿易公司）。

1.3 標準溶液的配置

準確稱取孔雀石綠0.010 g，用乙腈溶解，定容于100 mL容量瓶中，即得質量濃度為0.1 mg/mL的標準貯備溶液。使用時再用乙腈稀釋成相應濃度的溶液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：ODS－C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度 5 μm；流動相為 0.1 mol/L（pH 值 4.5）的乙腈：乙酸銨緩沖液（75∶25），流速為 1.0 mL/min；柱溫為 35℃；激發波長265 nm，發射波長360 nm；進樣量20 μL。

1.5 方法

1.5.1 提 取 稱取處理好的樣品約5.00 g置于50 mL離心管中，依次加入混合提取溶液20 mL、二甘醇2 mL、酸性氧化鋁5 g，混勻。超聲10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液至150 mL分液漏斗。繼續向離心管中加入15 mL的乙腈，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液并入150 mL分液漏斗中，重復一次。

在分液漏斗中加入15 mL的二氯甲烷，具塞，劇烈振搖2 min，靜置分層，將下層溶液轉移至100 mL雞心瓶中。在分液漏斗再加入5 mL乙腈，10 mL二氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，將下層溶液并入雞心瓶。45℃旋轉蒸發至近干，用3 mL乙腈溶解殘渣。

1.5.2 凈 化 將PRS柱子接到固相萃取裝置上，上端接中性氧化鋁柱，先用5 mL的乙腈分兩次活化柱子，轉移提取液到柱上，然后用4 mL乙腈分兩次洗滌雞心瓶，每次2 mL，洗液加入0.1 mL硼氫化鉀，輕輕振搖，依次過柱，棄去中性氧化鋁柱，抽PRS柱近干，最后用3 mL洗脫液洗脫，過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

2 結果與討論

2.1 孔雀石綠標準曲線

配制一系列不同濃度的標準溶液0.001、0.002、0.010、0.040、0.100、0.200 μg/mL，測定的線性范圍為 0.001～0.2 μg/mL，線性回歸方程 Y=0.164 a+0.051 7，相關系數r=0.999 9，結果表明孔雀石綠在0.001～0.2 μg/mL范圍內具有很好的線性，孔雀石綠標準曲線如圖1所示。Kamila等[6]研究認為孔雀石綠和無色孔雀石綠溶液能在光照下降解，光氧化生成脫甲基化合物，而添加抗壞血酸能緩解降解過程。SC/T 3018-2004標準要求樣品在前處理過程中盡量避光進行，也是由于孔雀石綠溶液的光降解特性。

圖1 孔雀石綠校正曲線

2.2 最低檢測限

取樣量不同，方法的檢出限也不同，本試驗采用5 g的取樣量，最后3 mL定容，以3倍噪音信號為最低檢出濃度，求出最低檢出限為0.5 μg/kg，可滿足歐盟對我國水產品中孔雀石綠檢測的要求（2 μg/kg）。

2.3 加標回收率的測定

在5 g草魚、鯽魚、鳙魚樣品中分別加入250、500和1 000 μL濃度為100 μg/L的孔雀石綠標準溶液（添加水平分別相當于 5、10、20 μg/kg），用玻棒攪勻，靜置30 min，樣品前處理后按方法所述中的色譜條件測定，對每個添加水平作5個平行，再重復2次，最后計算孔雀石綠的平均回收率和相對標準偏差，以分別考察方法的回收率和精密度。由表1可知，回收率為75.08%～95.13%，相對標準偏差為3.7%～7.1%。該加標回收率在70%～120%之間，相對標準偏差小于15%，符合檢測要求。由圖2可知，往空白樣添加孔雀石綠標液5 μg/kg，孔雀石綠目標峰在色譜圖中得到較好的分離并且峰形尖銳，回收率良好。

表1 回收率與精密度 （%）

圖2 空白樣品（A）和5 μg/kg加標樣品（B）的色譜圖

3 結論

用乙腈、乙酸銨緩沖溶液提取水產樣品中孔雀石綠后，乙腈再提取，二氯甲烷反萃取；并結合勻漿、振蕩提取、固相萃取等一系列提取凈化步驟，成功地進行了水產品中孔雀石綠殘留量的檢測。該方法回收率較高，可用于水產品中孔雀石綠殘留的批量檢測，是水產品中孔雀石綠及其代謝物殘留量快速而準確的檢測方法。

[1]GB/T 19857-2005水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量和測定[S].

[2]孫貝貝，房文紅.高效液相色譜技術在食品檢測中的應用[J].安徽農業科學，2010，38（35）：20454-20456，20490.

[3]Peter S,Alder A B.Determination of residues of malachite green in finfish by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2005，529:173-177.

[4]Luis V,Cecilia D,Andonia L Z,et al.Determination of the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon muscle by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2005,1067（1/2）:101-105.

[5]林 謙，林 煒，葉瑞洪.紫外可見分光光度法測定水產品中孔雀石綠含量[J].福建師范大學福清分校學報，2009，（5）：60-64.

[6]Kamilia M,Andrzej P,Jan Z.Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A,2005，1089:187-192.