丁草胺降解菌P10的分離鑒定及其對植株修復效果的研究

彭亞軍，程小梅，王俊華，李 欣，蔡海林，周小毛，柏連陽,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南人文科技學院，湖南 婁底 417000）

丁草胺是一種高效內(nèi)吸傳導型苯乙酰胺類芽前除草劑，對以種子萌發(fā)的雜草有很好的防除效果。由于其性質(zhì)穩(wěn)定，土壤中丁草胺的降解主要是由微生物完成的[1-4]，所以篩選丁草胺高效降解菌的意義重大。目前，已篩選出很多丁草胺高效降解菌[5-6]，但還未見利用降解菌來修復丁草胺藥害植株的相關報道。筆者通過室內(nèi)盆栽試驗研究了丁草胺降解菌P10對丁草胺藥害植株的修復效果，為丁草胺污染的生物治理提供了一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試原藥及培養(yǎng)基

土樣采自有長期生產(chǎn)丁草胺經(jīng)歷的江蘇常隆化工有限公司。

供試藥劑為95%的丁草胺原藥（安徽豐樂農(nóng)化有限責任公司）。

基 礎 鹽 培 養(yǎng) 基 ：K2HPO41 g，KH2PO41 g，NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，微量元素液1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2~7.4。

半固體基礎鹽培養(yǎng)基：在基礎鹽培養(yǎng)基中加入0.4%的瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7.0~7.2。

1.2 丁草胺降解菌的富集和分離

在含50 mg/L丁草胺的基礎鹽液體培養(yǎng)基中加入5 g采集的土樣，于30℃恒溫搖床中黑暗振蕩培養(yǎng)，振蕩頻率為150 r/min；每隔1周以5%（體積分數(shù)）的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，并逐步提高丁草胺濃度，至培養(yǎng)液中丁草胺濃度達到200 mg/L，如此馴化約1個月。于丁草胺LB培養(yǎng)基上劃線分離，選取長勢好的菌落純化3次，得到純化的丁草胺降解細菌。將純化好的細菌回接至丁草胺基礎鹽培養(yǎng)基中，取0 h、7 d樣各1 mL，10 000 r/min離心5 min后過0.45 μm的水相濾膜進液相色譜檢測。

1.3 液相色譜檢測條件

色譜柱：Kromasil 100-5C18 柱（5 μm）4.6 mm×150 mm；檢測波長：215 nm[7]；流動相：乙腈∶水=75∶25；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.4 菌株P10的鑒定

菌株P10的形態(tài)以及生理生化鑒定參照東秀珠等的方法[8]。P10的16S rDNA序列測定：采用細菌的16S rDNA通用引物，以細菌的總DNA為模板，對菌株的16S rDNA進行PCR擴增；PCR產(chǎn)物用GENEray膠回收試劑盒進行回收，將回收產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，以氨芐青霉素為篩選劑進行篩選；挑取陽性克隆斑，進行PCR驗證，同時用堿法提取質(zhì)粒進行測序；用BLAST分析序列的同源性，采用MEGA 5.05軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

16S rDNA 通用引物為：上游，5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游，5′-GGTTACCTTCTTACG ACTT-3′。反應體系（25 μL）為：10×EX-Taq buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，16S rDNA 上、下游引物各0.4 μL，EX-Taq 酶 0.2 μL，總 DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.5 μL。 PCR反應條件為：94℃預變性 6 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，擴增32個循環(huán)，72℃后延伸10 min。

1.5 菌株P10修復藥害植株試驗

處理1：半固體基礎鹽培養(yǎng)基滅菌后倒150 mL于250 mL燒杯中；處理2：半固體基礎鹽培養(yǎng)基滅菌稍放冷后，加入丁草胺儲備液，濃度為20 mg/L，倒150 mL于250 mL燒杯中；處理3：半固體基礎鹽培養(yǎng)基滅菌稍放冷后，加入丁草胺儲備液，濃度為20 mg/L，冷卻到50℃左右后加入10%經(jīng)基礎鹽培養(yǎng)基活化一周的P10培養(yǎng)液，倒150 mL于250 mL燒杯中。待凝固后播種經(jīng)清水浸種、催芽，且萌發(fā)一致的水稻種子，每盆20粒，每個處理3個重復。于28℃，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)10 d后觀察，記錄出苗個數(shù)、株高、株鮮重，50℃烘干至恒重后，稱取株干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁草胺降解菌P10的篩選

富集、純化后，篩選出一株丁草胺高效降解細菌P10，P10在 30℃、150 r/min黑暗搖床培養(yǎng) 7 d，能降解培養(yǎng)液中89.6%的丁草胺，所測降解液相圖譜見圖1，液相圖譜峰面積和丁草胺的濃度成正比，A為0 h取樣的檢測圖譜，B為只加丁草胺的空白樣7 d后取樣的檢測圖譜，C為加有降解菌P10的處理樣7 d后取樣的檢測圖譜。

2.2 菌株鑒定

圖1 P10 7 d對丁草胺的降解液相圖譜（A：0 h；B：空白；C：P10）

P10在LB平板上30℃培養(yǎng)1 d后，菌落呈乳白色，圓形、隆起、不透明，圖2為菌體在電鏡下的形態(tài)。通過理化性質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)：菌株P10與接觸酶、葡萄糖、甲基紅、V-P[檢測某種細菌分解碳水化合物產(chǎn)生乙酰甲基甲醇CH3CH（OH）COCH3的反應]、脲酶等反應呈陽性；與氧化酶、H2S產(chǎn)生、明膠液化、淀粉水解等呈陰性。抗藥性檢測的結(jié)果表明：P10對硫酸卡那霉素（20 mg/L）、硫酸鏈霉素（20 mg/L）和硫酸新霉素（20 U/mL）敏感；而對氨芐青霉素（20 mg/L）和氯霉素（20 mg/L）不敏感。菌株P10和相關菌株的16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明：菌株P10與 Klebsiella ornithinolytica（AJ251467.1）及Klebsiella sp.R-21934（AJ786796.1）的相似性均為99%，并且與它們共同組成一個分支，再結(jié)合P10的理化特征將其鑒定為克雷白氏桿菌屬（klebsiella sp.）（圖 3）。

圖2 P10的電鏡照片

圖3 P10菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株P10修復藥害植株試驗結(jié)果

從室內(nèi)藥害植株修復試驗結(jié)果來看，施加降解菌P10后對水稻的出苗率、株高及株重均有明顯影響（見表1），當盆栽中丁草胺濃度為20 mg/L，接菌量為10%時，水稻的出苗率、株高、株鮮重和株干重分別比空白組處理1低44%、60%、49%和55%；但是比含同樣濃度丁草胺、未接菌對照組處理2分別高129%、208%、178%和123%。降解菌株P10對丁草胺藥害水稻的出苗率和株鮮重均有極顯著的修復效果，對株高和株干重有顯著的修復效果。這說明在室內(nèi)條件下，降解菌能夠促進殘留丁草胺的降解，減輕其對水稻的藥害。

表1 菌株P10施用后對水稻生長指標的影響

3 討論

因為丁草胺長期大面積的使用，給環(huán)境帶來了很嚴重的危害，所以解決丁草胺危害問題迫在眉睫。利用高效降解菌消除除草劑殘留有運行成本低、無二次污染等優(yōu)勢，發(fā)展前景非常好，故應對利用微生物降解除草劑這一課題進行更多、更深層次的研究。

該研究篩選出的降解細菌P10被鑒定屬于克雷白氏桿菌屬，和已報道的丁草胺降解菌為不同屬，擴大了微生物治理的選擇范圍。有關該菌降解丁草胺的途經(jīng)將在后續(xù)工作中進一步研究。

目前微生物修復丁草胺藥害植株的研究還未見報道，通過室內(nèi)盆栽發(fā)現(xiàn)所篩選的丁草胺高效降解菌株對丁草胺藥害水稻植株的出苗率、株高以及株鮮、干重都有很好的修復效果，這為將來室外田間丁草胺藥害的修復提供了很好的指導作用。

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