樺皮素的提取純化及其含量測定研究

王 雷，任永春，范延新，楊志興

（1.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱，150090;2.萬生聯合制藥有限公司，吉林梅河口市，135000;3黑龍江省科學院，黑龍江哈爾濱，150001）

白樺(Betula platyphylla Suk.)為樺木科樺木屬植物，在我國東北地區資源豐富，樺樹皮中含有的樺皮素是一種重要的自然資源，它的藥理作用受到國內外學者的廣泛重視。研究表明白樺三萜類物質樺皮素為白色晶體粉末，無味，易溶于有機溶液，微或難溶于水，熔點在248～251℃（樺木醇）和316～318℃（樺木酸）。樺皮素對各類瘤株的抑瘤率達到30%以上,對黑色素瘤B16的效果最好，抑瘤率為51.4%，樺皮素可促進巨噬細胞和脾細胞分泌腫瘤壞死因子(TNE)，增加巨噬細胞的細胞毒性活性。樺皮素的生物學功能包括：抗腫瘤、抗炎抗菌、抗病毒（尤其抗艾滋病毒）、抗突變、抗衰老、抗氧自由基、抗缺氧，有戒毒作用，增加免疫機能，護肝保肝等功能[1～3]。臨床試驗發現，樺木酸極有可能開發成抗癌藥物應用于肝癌、腸癌、胃癌的治療[4]。另外樺皮素具有極強的抗結核桿菌作用，可用于結核病的治療[5～8]。

從樺樹皮中提取樺皮素的方法很多，本文應用乙醇提取法和乙醇與氯仿重結晶法，從樺樹皮中提取樺皮素，純度達到95%以上，該方法工藝簡單、溶液普通、成本廉價、結晶容易、收率較高。同時利用高效液相色譜法測定樺木醇含量，準確快捷。本研究為樺皮素的工業化生產提供理論依據和參考。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器和藥品

玻璃回流提取儀,恒溫水浴,RE5205旋轉蒸發器,粉碎機,LC-6A高效液相色譜儀（日本SHIMADZU）。對照品樺木醇為上海復旦大學生命科學院張教授提供。分析用試劑均購于promega公司。

1.2 方法

1.2.1 白樺樹皮的預處理

干燥的白樺樹皮粉碎至40目，取100g粉末用pH=12的蒸餾水浸泡，加熱至100℃，保持40min，冷卻并淋洗至中性，干燥備用。

1.2.2 樺木醇提取方法

以干燥的樺樹皮為材料，分別以95%乙醇、苯、氯仿、甲醇作為提取溶劑，75℃回流提取2h，收集濾液，重復提取一次，合并提取液。用旋轉蒸發器回收提取溶劑，至1/20體積，熱過濾，4℃結晶，濾出結晶，減壓干燥，得到粗品。

1.2.3 樺木醇結晶方法

粗品用8倍體積的的氯仿∶乙醇（1∶20）溶解，待完全溶解后，濾出雜質，溶液在4℃，重結晶，濾出結晶，減壓干燥，得到結晶品，稱重。

1.2.4 樺木醇含量的測定方法

應用高效液相色譜法測定樺木醇含量，色譜柱為ODSC18；流動相為甲醇∶水(88∶12)，紫外檢測波長為210nm，柱溫 30℃；柱壓6.4MPa，流速1mL/min。測定樣品用0.45μm微孔濾膜過濾，待高效液相基線平穩后，用微量注射器吸取10μl進樣(排除注射器中小氣泡)，每一樣品連續進樣三次取平均值，得出峰面積，計算出含量[9,10]。

2 結果與討論

2.1 不同提取方法對樺木醇收率的影響

對不同提取溶劑篩選，結果表明見表1，用甲醇和乙醇作為提取溶劑，收率相同且高于其他溶劑，乙醇對人體健康危害低，所以選用乙醇作為提取溶劑較為理想。以乙醇為提取溶劑獲得樺木醇粗提取物，樣品的純度用HPLC方法測定，結果如表2和圖1所示。粗提取的樺木醇純度在50%～70%之間。雖然熱回流法提取收率較高，但雜質較多，對檢測有一定干擾，故采用本方法之前，應先用堿性純水加熱煮沸10～30min，然后過濾，再用乙醇溶液正常熱回流提取樺木醇，該方法使產品的收率與純度均有所提高。圖中箭頭指樺木醇峰。

表1 不同提取溶劑對樺木醇粗提物收率的影響Table 1 Effect of different extraction solvents on Betulin yield of crude extracts

圖1 粗提樺木醇的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of crude extracts betulin

表2 乙醇回流溶液提取樺木醇的純度Table2 Content of betulin by Ethanol extract

2.2 不同溶劑體系對樺木醇重結晶效果的影響

提取的樺木醇粗品用不同的溶劑體系進行重結晶處理，結果發現不同溶劑體系對結晶效果有顯著影響，結果見表 3，從表 3數據可見，氯仿∶乙醇(1∶20)溶劑體系得到的重結晶樺木醇的純度與結晶收率最高，是理想的重結晶溶劑體系。利用該溶劑體系，溶解粗提取的樺木醇，完全溶解后，濾除雜質，溶液在4℃重結晶，濾出結晶，減壓干燥，得到結晶品。重結晶樺木醇，經HPLC測定結果如圖2所示。箭頭指出重結晶樺木醇峰。

圖2 重結晶樺木醇HPLC圖譜Fig.2 Chromatogram of recrystal betulin

表3 不同溶劑體系對結晶效果的影響Table 3 Effects of different solvents on the crystallization

2.3 樺木醇含量測定

高效液相色譜法測定白樺樹皮中樺木醇含量，結果如圖1,2,3所示。本方法的線性范圍為15.0～300.0ug/mL，平均回收率為93.93%，提取收率為85%～90%，粗品純度為60%～70%，重結晶純度大于95%。高效液相色譜法測定白樺樹皮中樺木醇和木樺酸含量的方法，保留時間合適，峰形好，適合定量分析。箭頭指出重結晶樺木醇峰。

圖3 樺木醇對照品HPLC色譜圖Fig.3 Chromatogram of control betulin

3 結論

通過對樺木醇不同提取試劑的篩選以及樺木醇重結晶不同溶劑體系的優化，結果顯示：以干燥的樺樹皮為材料，乙醇作為提取溶劑，獲得樺木醇粗提取物收率最高23%；樺木醇粗體物經氯仿∶乙醇（1∶20）重結晶后，樺木醇的純度達到95.07%，結晶收率34.05%。

[1]ALAKURTTI S,M KEL T,KOSKIMIES S,et al.Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin[J］.European Journal ofPharmaceutical Sciences,2006,29(1)∶1～13.

[2]ALEKSEEVNA K S,NIKOLAEVICHI K B,BORISOVNA L A,et al.Capillary—restorative agent：RU，2276980[P］.2006-05-27.

[3]KRASUTSKY P A,CARLSON R M,NESTERENKO V V,et al.Birch bark processing and the isolation of natural products from birch bark：WO,10885[P］.2001-02-15.

[4]CSUK R,SCHMUCK K,SCH?FER R.A practical synthesis of betulinic acid[J］.Tetrahedron Letters,2006,47(49)∶8769-8770.

[5]KUZNETSOVA S,KUZNETSOV B.Method of preparation of betulin：RU，2264411[P］.2005-11-20.

[6]李薇,李巖,金雄杰.白樺三萜類物質的抗腫瘤作用及其對免疫功能的增強效應[J］.中國免疫學雜志,2000,16(9)∶485-487.

[7]王石發,張明光,李艷蘋.樺木醇提取及純化工藝的研究[J］.林產化學與工業，2007，27(6)∶23～26.

[8]TANG J J,LI J G.,QI W,et al.Song B.L.Inhibition of SREBP by a Small Molecule,Betulin,Improves Hyperlipidermia and Insulin Resistance and Reduces Atherosclerotic Plaques [J］.Cell Metabolism,2011,13(5)∶44～56.

[9]張澤,孫宏.測定白樺樹皮中白樺酯醇的含量[J］.林產化學與工業,2004,24(1)∶61～63.

[10]丁為民,周丹,于濤,等.均勻設計法優化樺木醇超聲波輔助提取工藝[J］.林產化學與工業,2010,30(3)∶78～82.