尾索動物線粒體基因組特征比較及分子系統發育

申 欣, 田 美, 孟學平, 程漢良, 李士虎

(淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005)

與單個基因或者基因的片段相比, 線粒體基因組是一個完整的體系, 具有信息量豐富和系統發育樹結構穩定等優點, 在過去的十幾年間已被廣泛應用于后生動物分子系統演化和種群遺傳的研究[1-2]。尾索動物隸屬于脊索動物門(Chordata)、尾索動物亞門(Tunicata或者Urochordata), 為海洋生境中所特有的生物類群, 廣泛棲息于世界各大海洋中, 從潮間帶至深海均有分布。由于尾索動物在后生動物進化中處于特殊的關鍵位置, 其在免疫學、胚胎發育學、細胞學等各個學科領域對研究脊椎動物的起源與系統發育都有著不可取代的作用[3-4]。在GenBank線粒體基因組的數據庫中, 目前有12個尾索動物的線粒體基因組全序列。作者在12個尾索動物線粒體基因組研究的基礎上, 全面分析此類群線粒體基因組的基本特征、基因排列、蛋白質編碼基因、選擇壓力、變異位點和分子系統發育等。

1 材料和方法

1.1 數據獲取

從GenBank線粒體基因組數據庫中檢索、下載得到12個尾索動物線粒體基因組全序列。分別是隸屬于海鞘綱(Ascidiacea)、內性目(Enterogona)的燈泡簇海鞘(Clavelina lepadiformis)、群體海鞘(Diplosoma listerianum)、胃海鞘(Aplidium conicum)、黑色次口海鞘(Phallusia fumigata)、具疣次口海鞘(Phallusia mammilata)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和薩氏海鞘(Ciona savignyi), 褶鰓目(Stolidobranchia)的真海鞘(Halocynthia roretzi)、莫馬斯赫海鞘(Herdmania momus)、小海鞘(Microcosmus sulcatus)和皺瘤海鞘(Styela plicata)以及樽海鞘綱(Thaliacea)的樽海鞘(Doliolum nationalis)[5-11]。

1.2 選擇壓力分析

為了檢驗選擇壓力對于尾索動物(以玻璃海鞘屬為代表)線粒體基因組的影響, 通過 Clustal X[12]對線粒體基因組蛋白質編碼基因的核苷酸序列進行多重序列比對。同義替換率(Ks)和非同義替換率(Ka)通過PAML[13]和DnaSP 4.10.7[14]進行了估算。

1.3 基因變異特征分析

分別以12個尾索動物、2個玻璃海鞘屬物種(玻璃海鞘和薩氏海鞘)和 2個次口海鞘屬物種(黑色次口海鞘和具疣次口海鞘)線粒體基因組作為數據群進行了基因變異位點分析, 蛋白質編碼基因和核糖體RNA基因的核苷酸序列通過Clustal X[12]進行多重序列比對。然后通過DnaSP 4.10.7[14]分析了線粒體基因組主編碼基因變異位點特征。

1.4 系統發育分析

線粒體基因組 12個蛋白質編碼基因(由于部分物種atp8缺失, 所以將其排除在外)的氨基酸序列通過Clustal X[12]進行多重序列比對。然后, 通過兩種方法(貝葉斯法和最大似然法)進行系統發育重建,使用的軟件分別為MrBayes[15]和PHYML[16]。在貝葉斯分析中, 馬爾可夫鏈需要運行1 000 000個世代(構樹頻率=1000世代), 從而保證達到收斂, 并估算貝葉斯的先驗概率(以 BPP表示)。在最大似然法中,通過自展法(Bootstrap＝1000)評估節點的可靠性(以BPM表示)。

2 結果和討論

2.1 線粒體基因組的基本特征

在脊椎動物線粒體基因組中,nad6基因和一系列轉運RNA基因通常在負鏈上編碼。在頭索動物線粒體基因組中, 也存在與脊椎動物線粒體基因組類似的基因分布特征[17-18]。然而, 12個尾索動物線粒體基因組的所有基因均在同一鏈上編碼, 這與脊椎動物、頭索動物線粒體基因組的基因分布特征顯著不同。

尾索動物線粒體基因組長度介于13 648bp(群體海鞘)和 16 351bp(樽海鞘)之間。尾索動物線粒體基因組的基因組成與后生動物線粒體基因組標準的基因組成并不完全一致, 存在轉運RNA基因數目的增加, 同時在燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘的線粒體基因組中缺乏atp8基因(表1)。線粒體基因組主編碼鏈的A＋T含量差別很大, 最高的達到80.8%(群體海鞘), 最低的僅為52.9%(具疣次口海鞘)。尾索動物線粒體基因組的基本特征見表1。

表1 尾索動物線粒體基因組的基本特征Tab. 1 Basic features of tunicates mitochondrial genomes

2.2 基因排列

在12個尾索動物線粒體基因組中, 發生了大規模的基因重排。即使排除容易發生易位的轉運RNA基因, 它們的基因排列順序也顯著不同(圖 1)。在同屬物種的線粒體基因組中, 也存在主編碼基因的基因重排和基因缺失。在玻璃海鞘屬, 與玻璃海鞘線粒體基因組相比, 薩氏海鞘的nad1基因發生易位, 同時atp8基因發生了缺失(圖1)。在次口海鞘屬, 僅存在 2個保守的基因區塊: (1)cox2-cob和(2)nad2-nad4L-cox3, 而其他基因的排列順序均發生了改變(圖1)。

與尾索動物線粒體基因組相比, 在頭索動物線粒體基因組中, 基因排列順序較為保守[17-18]。盡管2個類群(尾索動物和頭索動物)均為脊椎動物的近親,但在線粒體基因組基因排列的特征上卻有如此顯著的差別, 說明在2個類群之間, 線粒體基因組的進化機制和選擇壓力可能會存在明顯差異, 在今后應該得到進一步的關注和探究。

圖1 尾索動物線粒體主編碼基因的基因排列(不包含轉運RNA基因)Fig. 1 Gene order of tunicates mitochondrial major coding genes (transfer RNA genes are excluded)

2.3 蛋白質編碼基因

在 3個物種(燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘)的線粒體基因組中存在atp8基因的缺失, 其余的 9個物種均包含后生動物線粒體基因組標準的13個蛋白質編碼基因。在樽海鞘線粒體基因組的蛋白質編碼基因中, 最為常用的起始密碼子為“TTG”; 而在11個海鞘綱物種的線粒體蛋白質編碼基因中,“ATG”出現的比例最高。除了這兩種起始密碼子外, 同時還存在“ATA”、“ATT”和“GTG”等3種起始密碼子。真海鞘線粒體基因組所有的蛋白質編碼基因均以完全終止密碼子“TAA”或者“TAG”終止, 余下的 11個物種部分蛋白質編碼基因中, 存在不完全的終止密碼子(“TA-”或者“T-”)(表2)。尾索動物線粒體基因組蛋白質編碼基因所編碼的氨基酸數目并不保守。群體海鞘的cox2基因編碼313氨基酸, 比薩氏海鞘的cox2基因超出 92個氨基酸;而同時, 玻璃海鞘的nad2基因編碼 369個氨基酸,與群體海鞘的nad2基因相比, 多了83個氨基酸(表2)。

2.4 選擇壓力

為了分析尾索動物線粒體基因組蛋白編碼基因的選擇壓力, 統計了玻璃海鞘和薩氏海鞘蛋白質編碼基因的同義替換率(Ks)和非同義替換率(Ka)。2個玻璃海鞘線粒體基因組 12個蛋白質編碼基因的Ka/Ks比值都低于1(介于0.0927和0.6752之間), 顯示出一定的負(純化)選擇(圖 2)。其中,nad6基因的Ka/Ks比值最高(0.6752), 其次是nad3和nad2基因(分別為 0.4321和 0.3916), 因此表明, 在 13個蛋白質編碼基因中,nad6、nad3和nad2基因承受較小的選擇壓力和功能束縛。同時,cox1基因的Ka/Ks比值最低(0.0927), 其次是nad1和cob基因(分別為0.1353和 0.1484), 從而說明, 在尾索動物線粒體基因組中,cox1、nad1和cob基因承受較強的選擇壓力和功能束縛。

表2 尾索動物線粒體基因組蛋白質編碼基因的氨基酸數量及起始、終止密碼子Tab. 2 Amino acids number, initiation and termination codons in protein-coding genes of tunicates mitochondrial genomes

圖2 玻璃海鞘線粒體基因組蛋白質編碼基因的Ka/Ks分析Fig. 2 The ratio of Nonsynonymous and synonymous substitutions rates (Ka/Ks)was estimated in protein-coding genes of Ciona mitochondrial genomes

2.5 基因變異位點特征

在種群遺傳學的研究中, 選擇合適的分子標記至關重要。以12個尾索動物、2個玻璃海鞘屬物種(玻璃海鞘和薩氏海鞘)和 2個次口海鞘屬物種(黑色次口海鞘和具疣次口海鞘)線粒體基因組作為數據群,分別進行了基因變異位點分析。在尾索動物線粒體基因組14個主編碼基因中,cox1基因最為保守, 變異位點的比例為61.57%。Cob、cox2-3、nad1和lrRNA等 5個基因變異位點的比例介于 70%～80%;atp6、nad3-5、srRNA和nad4L等6個基因變異位點的比例介于 80%～90%;nad2和nad6變異位點的比例超過90%(表3)。變異位點數最多的基因為nad5基因(1120個), 其次為nad4和cox1基因, 變異位點數分別達到1005和 931個。因此, 在尾索動物種群遺傳的研究中,nad5和nad4基因可以作為備選的分子標記。

表3 尾索動物線粒體基因組蛋白質編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點分析Tab. 3 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in tunicates mitochondrial genomes

在玻璃海鞘屬線粒體基因組的主編碼基因中,cox1和cox2基因最為保守, 變異位點的比例分別為16.21%和18.85%; 變異位點數最多的基因為nad5基因(462個), 其次為nad4基因(331個)(表4)。與玻璃海鞘屬線粒體基因組類似, 在次口海鞘屬線粒體基因組主編碼基因中,cox2和cox1基因最為保守, 變異位點的比例分別為23.68%和23.97%; 變異位點數最多的基因為nad5基因(618個), 其次為nad4基因(527個)(表5)。因此, 在玻璃海鞘和次口海鞘種群遺傳的研究中,nad5和nad4仍然可以作為備選的分子標記。

表4 玻璃海鞘屬線粒體基因組蛋白質編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點分析Tab. 4 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in Ciona mitochondrial genomes

表5 次口海鞘屬線粒體基因組蛋白質編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點分析Tab. 5 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in Phallusia mitochondrial genomes

綜上所述, 在尾索動物種群遺傳的研究中,nad5和nad4可以作為備選的分子標記, 用于分析不同物種之間的遺傳多樣性, 為其生物多樣性的保護及合理利用其生物資源提供更多保障。

2.6 系統發育關系分析

目前在國際上, 基于線粒體基因組數據分析尾索動物內部的系統發育關系才剛剛興起[5,8], 對 12個尾索動物線粒體基因組進行全面的系統發育分析尚未見報道。作者基于12個線粒體基因組蛋白質編碼基因的氨基酸序列, 通過兩種方法(貝葉斯法和最大似然法)所構建系統發育樹的拓撲結構完全一致(圖 3)。從系統發育樹的結果可以看出, 尾索動物分為兩個分支: 海鞘綱和樽海鞘綱(BPP=100,BPM=100)。在海鞘綱內部, 小海鞘、皺瘤海鞘、真海鞘和莫馬斯赫海鞘聚為一支, 從而支持褶鰓目為單系群(BPP=100, BPM=100)。具疣次口海鞘和黑色次口海鞘單獨聚為一支(BPP=100, BPM=100), 從而導致內性目并非單系群。線粒體基因組的數據支持尾索動物在科級的親緣關系為: (((柄海鞘科+芋海鞘科)+(((三段海鞘科+星骨海鞘科)+簇海鞘科)+玻璃海鞘科))+長紋海鞘科)+海樽科(圖3)。

圖3 基于線粒體基因組蛋白質編碼基因的氨基酸序列構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on aligned amino acids sequences from mitochondrial protein coding genes

3 結論

作者在12個尾索動物線粒體基因組全序列的基礎上, 全面分析尾索動物線粒體基因組的基本特征、基因排列、蛋白質編碼基因、選擇壓力、變異位點和分子系統發育等。12個尾索動物線粒體基因組的所有基因均在同一鏈上編碼, 這與脊椎動物、頭索動物線粒體基因組的基因分布特征顯著不同。尾索動物線粒體基因組的基因組成與后生動物線粒體基因組標準的基因組成并不完全一致, 存在轉運RNA基因數目的增加, 同時在燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘的線粒體基因組中缺乏atp8基因。在12個尾索動物線粒體基因組中, 發生了大規模的基因重排, 即使在同屬物種的線粒體基因組中, 也存在主編碼基因的基因重排和基因缺失。尾索動物線粒體基因組蛋白質編碼基因使用的起始密碼子、終止密碼子及氨基酸長度存在差異。2個玻璃海鞘線粒體基因組12個蛋白質編碼基因的Ka/Ks比值都低于 1(介于0.0927和0.6752之間), 顯示出一定的負選擇。在尾索動物群體遺傳的研究中,nad5和nad4可以作為備選的分子標記, 用于分析不同物種和種群之間的生物多樣性。基于線粒體基因組蛋白質編碼基因的氨基酸序列, 支持將尾索動物分為兩個分支: 海鞘綱和樽海鞘綱。尾索動物在科級的親緣關系為: (((柄海鞘科+芋海鞘科)+(((三段海鞘科+星骨海鞘科)+簇海鞘科)+玻璃海鞘科))+長紋海鞘科)+海樽科。

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