響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備藻藍(lán)蛋白抗氧化肽的實(shí)驗(yàn)研究

唐志紅, 焦緒棟, 周云麗, 周 虹, 呂家森, 秦 松

(1. 煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 2. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003)

藻藍(lán)蛋白是存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻中的一類光合輔助色素, 由開(kāi)鏈四吡咯化合物和脫輔蛋白通過(guò)硫鏈鍵結(jié)合, 是螺旋藻細(xì)胞中起重要光合作用的天然色素, 在螺旋藻中的含量高達(dá) 10%～20%[1]。大量研究表明, 藻藍(lán)蛋白具有抗氧化[2]、抗輻射[3]、提高機(jī)體免疫力[4]、促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞再生[5]、抑制癌細(xì)胞[6]等作用, 這就決定了螺旋藻及其活性成分在功能性食品、藥物研究與開(kāi)發(fā)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。我國(guó)對(duì)藻藍(lán)蛋白的研究始于20世紀(jì)70年代, 經(jīng)過(guò)30多年的研究開(kāi)發(fā), 雖然有較大進(jìn)展, 但大都處于實(shí)驗(yàn)室水平。同時(shí), 以藻藍(lán)蛋白為主的功能性食品不多,在藥品的研究開(kāi)發(fā)方面還是空白[7]。采用酶解的方法將藻藍(lán)蛋白降解為可溶性寡肽, 則可大大提高其在食品中的理化性能, 并有可能獲得其前體沒(méi)有的生理活性。因此, 將藻藍(lán)蛋白進(jìn)行酶解處理具有較大的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)對(duì)藻藍(lán)蛋白進(jìn)行酶解制備抗氧化肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以對(duì)超氧陰離子和羥基自由基的清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo),應(yīng)用響應(yīng)面分析方法對(duì)堿性蛋白酶制備藻藍(lán)蛋白抗氧化肽的酶解工藝進(jìn)行了研究, 為藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

藻藍(lán)蛋白(A620/A280>2), 由本實(shí)驗(yàn)室從螺旋藻((Spirulina platensis)中提純得到; 堿性蛋白酶, 上海江萊生物科技有限公司; 其他均為分析純?cè)噭? pH儀, 上海任氏有限公司; HH-6恒溫水浴鍋, 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司; TDL-5型臺(tái)式離心機(jī),上海安亨科學(xué)儀器廠; 721型分光光度計(jì), 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白堿性蛋白酶水解工藝

稱取適量藻藍(lán)蛋白溶于 20 mL去離子水中, 在一定溫度下恒溫水浴酶反應(yīng)器中溶解 20 min, 然后按不同[E]/[S]、pH、溫度酶解一定的時(shí)間, 到所需反應(yīng)時(shí)間后將酶解液置于95℃中滅酶10 min, 冷卻后離心(4 000 r/min, 15 min), 將上清液凍干備用。

1.2.2 響應(yīng)面(RSM)因素的確定

在探討酶作用溫度、時(shí)間、pH、[E]/[S]和底物濃度等單因素對(duì)酶解作用影響的基礎(chǔ)上, 確定了酶作用的適宜 pH為 8.5, 底物濃度為 5%, 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理, 以X1(溫度)、X2(時(shí)間)和X3([E]/[S])為自變量, 以超氧陰離子自由基清除率(Y)為響應(yīng)值, 設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)的因素和水平的取值見(jiàn)表l。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert7.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。通過(guò)將優(yōu)化試驗(yàn)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進(jìn)行擬合, 以驗(yàn)證模型的可靠性。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Tab. 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 分析方法

藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物清除超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定, 采用鄰苯三酚自氧化法[8]。分別稱取適量藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物溶解于1 mL的蒸餾水中, 取0.1 mL加入2.8 mL 0.1mol／L的Tris-HCl緩沖溶液pH 8.2), 空白對(duì)照管以雙蒸餾水代替樣品, 震蕩混勻,在25℃水浴保溫10 min后加入0.1 mL、3 mmol／L的鄰苯三酚溶液(25℃水浴預(yù)熱), 迅速混勻并開(kāi)始計(jì)時(shí), 每隔30 S在325 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)325, 5 min后結(jié)束, 以0.1 mL雙蒸水加2.8 mL 的Tris·HCL緩沖溶液調(diào)零。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程, 其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V, 按下式計(jì)算樣品對(duì)超氧陰離子的清除率:

式中,V對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率, △A／min;V樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率, △A／min。

還原能力的測(cè)定, 鐵氰化鉀法[9]。

清除羥基自由基能力測(cè)定, 采用Fenton反應(yīng)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)對(duì)影響藻藍(lán)蛋白酶解的三個(gè)因素X1(溫度)、X2(時(shí)間)和X3([E]/[S])進(jìn)行了15組試驗(yàn), 來(lái)尋找上述3因素的最佳條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.1 回歸方程的建立

以超氧陰離子自由基清除率(Y)為響應(yīng)值指標(biāo),通過(guò)design expert7.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表3的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析, 得到X1(溫度)、X2(時(shí)間)和X3([E]/[S])3個(gè)因素與Y之間的回歸方程(模型)為:

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析, 結(jié)果見(jiàn)表 3。該模型的Pr>F值為 0.0096, 說(shuō)明模型回歸高度顯著; 失擬項(xiàng)Prob>F=0.0668＞0.1, 失擬不顯著, 說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好; CV為10.16%, 較低, 說(shuō)明試驗(yàn)操作可信, 綜上可以確定回歸方程(1)為堿性蛋白酶制備藻藍(lán)蛋白抗氧化肽提供了一個(gè)理想的模型, 故可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。從3因素(X1、X2、X3)對(duì)酶解產(chǎn)物的水解度的影響來(lái)看, 方程中X12和X32項(xiàng)對(duì)Y值的影響高度顯著,X1、X3和X1X2項(xiàng)對(duì)Y值的影響顯著, 其他項(xiàng)對(duì)Y值的影響不顯著, 分析結(jié)果表明響應(yīng)值的變化非常復(fù)雜,三個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有很大的影響。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Design and result of Box-Behnken test

圖1 酶解溫度和時(shí)間對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響Fig. 1 Response surface plots for the effects of hydrolysis temperature and time on the scavenging rate of superoxide anion radicals

根據(jù)模型方程(1)繪制響應(yīng)曲面見(jiàn)圖1、圖2和圖3。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值, 響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等值線中最小橢圓的中心點(diǎn)。通過(guò)嶺嵴分析得到水解度(Y)最高時(shí)的酶解優(yōu)化組合為X1=0.468、X2=6937和X3=0.307, 即溫度為44.9℃、時(shí)間為6.4 h和[E]/ [S]為 3.6%, 此時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到75.15%。

表3 回歸方程方差分析Tab. 3 Analysis of variance for regression equation

圖2 酶解溫度和[E]/ [S]對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響Fig. 2 Response surface plots for the effects of hydrolysis temperature and [E]/ [S]on the scavenging rate of superoxide anion radicals

2.1.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證回歸模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性, 采用上述優(yōu)化后的酶解工藝條件, 即溫度44.9℃、時(shí)間6.4 h、[E]/ [S]為3.6%、[S]5.0%、pH 8.5進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn), 3次試驗(yàn)的超氧陰離子自由基清除率平均為 75.39%,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在土1%以內(nèi), 說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好, 能較好反映酶解過(guò)程中超氧陰離子自由基清除率。

圖3 酶解時(shí)間和[E]/[S]對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響Fig. 3 Response surface plots for the effects of hydrolysis time and [E]/ [S]on the scavenging rate of superoxide anion radicals

2.2 藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物的還原能力

研究表明, 抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯(lián)系。抗氧化劑是通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基的, 還原力越強(qiáng), 抗氧化性越強(qiáng)。因此可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明抗氧化活性的強(qiáng)弱[11]。藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物(在優(yōu)化后的酶解工藝條件下獲得)的還原能力見(jiàn)圖4。在濃度為0.1～0.5 g/L時(shí), 藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物的還原能力隨濃度的增大而提高, 當(dāng)濃度為 0.5 g/L時(shí)吸光度達(dá) 1.03, 還原能力略高于VC。

圖4 藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物的還原能力Fig. 4 The reducing power of antioxidant peptides from phycocyanin

3 結(jié)論

根據(jù) Box-Behnken設(shè)計(jì)原理采用三因素水平的響應(yīng)面分析法, 對(duì)影響藻藍(lán)蛋白抗氧化肽制備的三個(gè)主要因素: 溫度、時(shí)間、[E]/[S]進(jìn)行了優(yōu)化, 選取合適的取值范圍, 并對(duì)各因素的最佳水平進(jìn)行了研究, 建立了溫度、時(shí)間、[E]/[S]與超氧陰離子自由基清除率之間的數(shù)學(xué)模型, 模型的回歸效果顯著, 能很好地預(yù)測(cè)超氧陰離子自由基清除率。優(yōu)化后的酶解工藝條件, 即溫度 44.9℃、時(shí)間 6.4 h、[E]/[S]3.64%、[S]5.0%、pH 8.5, 在此條件下, 實(shí)際超氧陰離子自由基清除率為75.39%, 與模型理論值75.15的相對(duì)誤差在土1%以內(nèi), 說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好, 能較好反映酶解過(guò)程中超氧陰離子自由基清除率。在優(yōu)化條件下制備的藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物在0.5 g/L時(shí)吸光度達(dá)1.03, 還原能力略高于 VC, 說(shuō)明藻藍(lán)蛋白酶解產(chǎn)物具有顯著的還原能力。本研究對(duì)于藻藍(lán)蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。

[1]郝瑋, 潘凌. 螺旋藻藻藍(lán)蛋白生理活性的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2006, 12(2): 111-113.

[2]Patel A, Mishra S, Ghosh P K. Antioxidant Potential of C-Phyeoeyanin isolated from cyanobaeterial species Lynghya, Phormidium andSpirulinaspp.[J].Indian J Bochem Bophys, 2006, 43(1): 25-31.

[3]Gonzalez R, Rodriguez S, Romay C H,et al.Anti-inflammatory activityof phycocyanin extract in acetic acid-induced colitis in rats[J]. Pharmacol Res,1999, 39(1): 1055-1059.

[4]唐玫, 金鷹, 郭寶江, 等. 螺旋藻藻藍(lán)蛋白對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 19(5): 93-97.

[5]張成武, 曾昭琪, 張媛貞, 等. 藻藍(lán)蛋白對(duì)小鼠粒單系祖細(xì)胞生成的影響[J]. 中國(guó)海洋藥物, 1996, 60(4):25-28.

[6]關(guān)燕清, 郭寶江. 硒化藻藍(lán)蛋白生物材料抗肝癌作用的研究[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 3(1): 40-44.

[7]陳志桃, 王立興, 林維欽. 螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 海峽藥學(xué), 2003, 15(6): 1-5.

[8]李艷紅, 劉堅(jiān), 張濤, 等. 酶解鷹嘴豆蛋白制備抗氧化肽工藝優(yōu)化研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(1):268-273.

[9]張強(qiáng), 周正義, 王松華. 從米糠中制備抗氧化肽的研究[J], 食品工業(yè)科技, 2007, 28(7): 145-148.

[10]牟雪姣, 張強(qiáng), 邢靜, 等, 雞血紅蛋白抗氧化肽的制備工藝研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2009, 3: 54-57.