缺氧應激對HepG-2細胞AFP和ICAM-1表達的影響

盧根林，鄧 勇，閆興軍

（1.義烏市中心醫院，浙江 義烏322000；2.青海大學附屬醫院，青海 西寧810001）

缺氧應激對HepG-2細胞AFP和ICAM-1表達的影響

盧根林1，鄧 勇2，閆興軍1

（1.義烏市中心醫院，浙江 義烏322000；2.青海大學附屬醫院，青海 西寧810001）

目的：探討缺氧應激對HepG-2細胞甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）和細胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1表達的影響。方法：缺氧（5%O2、5%CO2、90%N2）和常氧培養 HepG-2細胞。細胞侵襲實驗測定HepG-2細胞侵襲能力；四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法測定細胞增殖活性；逆轉錄聚合酶鏈反應技術測定常氧組和缺氧12、24h組 HepG-2細胞AFPmRNA和ICAM-1mRNA的表達量。流式細胞儀技術測定ICAM-1蛋白表達，放射免疫法測定HepG-2細胞培養上清AFP蛋白表達。結果隨著缺氧時間的延長HepG-2細胞的侵襲能力、增殖活性、AFP、ICAM-1 mRNA和蛋白表達量明顯增高（P＜0.01）。結論：缺氧應激下人HepG-2細胞侵襲能力增強的機制之一是ICAM-1基因表達上調；HepG-2細胞增殖活性增強的機制之一是HepG-2細胞AFP基因的表達上調。

缺氧應激；HepG-2細胞；甲胎蛋白；細胞間粘附分子-1

腫瘤侵襲、轉移是多因素、多步驟的生物學過程，其發生有賴于腫瘤細胞運動侵襲能力增強、不同時相細胞粘附與解粘附、降解并穿過細胞外基質進入血液和淋巴循環［1］。實體瘤存在著缺氧的局部微環境，缺氧時腫瘤細胞增殖活性、侵襲和轉移能力增強，糖酵解途徑上調、對化療藥物耐藥性增強，對放療敏感下降［1］。本研究模擬肝癌缺氧微環境，探討缺氧應激對人肝癌細胞HepG-2細胞侵襲能力和增殖活性和AFP、ICAM-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

人肝癌細胞株HepG-2引自蘭州軍區總醫院實驗科（來源于美國國立腫瘤研究所），胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產品，MTT、DMSO和胰蛋白酶均為美國Sigma產品，RT-PCR Kit購于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產品。人β-肌動蛋白（β-actin）、AFP和ICAM-1基因聚合酶鏈反應引物序列如下：β-actin上游引物 5′-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3′，下游引物 5′-ATCCACACGGAGTACTTGCGCTCA-3′，目的片段長 度 為600bp；AFP 上游引物 5′-GTTCCAGAACCTGTCACAAG-3′，下 引 物 5′-CTTTGTTTGGAAGCATTCAACTGC-3′，目的片段長度為 193bp；ICAM-1 上游引物 5′-TGGTAGCAGCCGCAGTCATA-3′，下引物 5′-CTCCTTCCTGGCTTAGT-3′，目的片段長度為377bp；由Invitrogen公司合成。兔抗人 ICAM-1多克隆抗體，羊抗兔IgG-FITC熒光標記二抗均購自武漢博士德公司，AFP試劑盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 體外細胞培養及實驗分組

人HepG-2細胞置滅活10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2培養箱中培養，每3-5天傳代一次。缺氧12、24小時組 HepG-2細胞置37℃、5%O2、5%CO2、90%N2三氣培養箱中分別培養 12、24h。

1.3 HepG-2細胞增殖活性檢測［2］

用四甲基偶唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖活性的變化，設置無細胞孔做空白對照，置Bio-Tek酶標儀上選擇490nm波長讀吸光度（A），各孔的A值=各孔所測A值-空白對照孔所測A值。

1.4 細胞侵襲實驗［3］

Matrigel（30μg/孔）鋪于Transwell小室8μm聚碳酸酯微孔濾膜上、過夜干燥并水化Matrigel。Transwell上室為2×105個HepG-2細胞（細胞活力＞95%），下室為含 10μg/ml Fibronectin完全培養基600μl，每組設 6 個平行孔，37℃常氧或缺氧孵育12h、24h。取出 Transwell小室，PBS洗 2次，用滅菌棉簽擦去濾膜上表面未穿膜的細胞和Matrigel，95%酒精固定15分鐘，HE染色，隨機選擇10個100×視野并計數。

1.5 各組HepG-2細胞AFP、ICAM-1mRNA表達

Trizol一步法提取細胞總RNA，電泳見28S、18S條帶，以 2.5μg總 RNA為模板，以 Takara公司的Random Premier為引物進行逆轉錄反應合成cDNA。AFP和β-actin PCR的反應條件為：95℃預變性3分鐘后，95℃ 變性 30s、60℃退火 30s、72℃延伸 50s共35個循環，72℃延伸7分鐘。ICAM-1和β-actin PCR的反應條件為：95℃預變性3分鐘后，95℃ 變性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸50秒共35個循環，72℃延伸7分鐘。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以 AFP/β-actin和 ICAM-1/β-actin值分別表示AFP、ICAM-1 mRNA含量。

1.6 各組HepG-2細胞ICAM-1蛋白表達

1.6.1 培養細胞和取樣取對數生長期的HepG-2細胞，按每孔5×105個接種于6孔板，常氧組HepG-2細胞于常氧培養24小時；缺氧12、24小時組HepG-2細胞于缺氧培養12、24小時，收集細胞，離心，PBS洗滌2次，用75%冷乙醇（4℃）固定，4℃保存。

1.6.2 采用免疫熒光間接法 檢測細胞前經1500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，PBS洗滌2次，加20μl（1：20）兔抗人ICAM-1抗體，37℃水浴30分鐘，PBS洗滌2次，加20μl（1：50）羊抗兔IgG-FITC熒光標記二抗，另設不加ICAM-1抗體只加IgGFITC熒光標記二抗作為空白對照組，37℃水浴30分鐘，PBS洗滌2次，4℃保存，待測。

1.6.3 流式細胞儀檢測 采用美國Becton-Dickson公司的FACSan流式細胞儀進行檢測，每樣品收集1×105個細胞，用 Clifit軟件進行分析，參照Morkve［4］等提出的熒光指數（Fluorescence index，FI）表示ICAM-1蛋白的相對含量。

1.7 各組HepG-2細胞培養上清AFP含量的測定

取處于對數生長期的HepG-2細胞，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養板，常氧組HepG-2細胞于常氧培養24小時；缺氧12、24小時組HepG-2細胞于缺氧培養12、24小時；吸取細胞培養上清經1000rpm離心15分鐘，取上清用于AFP含量的RIA檢測。

1.8 統計學處理

應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本均數間兩兩比較用q檢驗。

2 結 果

2.1 HepG-2細胞AFP、ICAM-1mRNA表達

常氧組和缺氧12h、24小時組總RNA的28S/18S=2：1，表明所提取的總RNA完整性好，可用于RT-PCR實驗。圖1、2和表1示：隨著缺氧時間的延長HepG-2細胞的AFP、ICAM-1 mRNA表達量明顯增高（P＜0.01），兩者正相關（r=0.754，P＜0.05）。提示缺氧應激上調 HepG-2細胞 AFP、ICAM-1 mRNA表達。

2.2 HepG-2細胞AFP、ICAM-1蛋白表達

隨著缺氧時間的延長HepG-2細胞的AFP、ICAM-1蛋白表達量明顯增高（P＜0.01），兩者正相關（r=0.769，P＜0.05）。提示缺氧應激上調HepG-2細胞 AFP、ICAM-1蛋白表達（見表1）。

表1 缺氧應激對HepG2細胞ICAM-1及AFP分子表達的影響（N=6，±SD）

表1 缺氧應激對HepG2細胞ICAM-1及AFP分子表達的影響（N=6，±SD）

注：*：與常氧組比較P＜0.01；#：與缺氧12h組比較 P＜0.01

值）常氧組 0.037±0.001 0.51±0.02 26.17±3.38 0.42±0.05 55±5 0.26±0.01缺氧12h組 0.051±0.002* 0.68±0.03* 44.25±3.87* 0.52±0.05* 67±4* 0.30±0.01*缺氧24h組 0.080±0.002*# 0.84±0.03*# 52.70±4.03*# 0.59±0.06*# 91±3*# 0.37±0.02*#組別 ICAM-1蛋白表達ICAM-1mRNA表達AFP蛋白表達（ng/ml） AFPmRNA表達 侵襲細胞數（個/HP）增殖活性（A

2.3 缺氧應激下HepG-2細胞增殖活性的改變

表1顯示：隨著缺氧時間的延長HepG-2細胞的增殖活性明顯增高（P＜0.01）。HepG-2細胞增殖活性與 AFP蛋白及 mRNA表達呈正相關（r=0.691、0.781，P ＜0.01）。

2.4 缺氧應激下HepG-2細胞侵襲力的改變

表1顯示：隨著缺氧時間的延長HepG-2細胞的侵襲能力明顯增高（P＜0.01）。侵襲力和ICAM-1蛋白及mRNA表達呈正相關（r=0.742、0.754，P ＜0.01）。

圖1 HepG-2細胞AFP mRNA表達

圖2 HepG-2細胞ICAM-1 mRNA表達

圖3 A、B、C分別表示常氧、缺氧12h、24hHepG-2細胞ICAM-1蛋白表達

3 討 論

腫瘤侵襲、轉移是多因素、多步驟的生物學過程，其發生有賴于腫瘤細胞運動侵襲能力增強、不同時相細胞粘附與解粘附、降解并穿過細胞外基質進入血液和淋巴循環［1］。實體瘤存在著缺氧的局部微環境，缺氧時缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表達上調，轉位到細胞核內與HIF-1β形成異二聚體HIF-1，HIF-1與其靶基因啟動子或增強子的缺氧反應元件（hypoxia response element，HRE）5′-ACGTGC-3′結合，上調靶基因的表達，使腫瘤細胞增殖活性、侵襲和轉移能力增強，糖酵解途徑上調、對化療藥物耐藥性增強，對放療敏感下降［1］。前期的研究表明缺氧應激下 HepG-2細胞HIF-1表達［2］。本研究顯示：缺氧應激下人HepG-2細胞的侵襲能力、增殖活性增強，與文獻［1］相一致。

AFP基因屬于白蛋白基因家族，有3個增強子，是原發性肝細胞癌診斷的重要血清標記物，參與細胞增殖和代謝的調節，能促進肝癌細胞增殖［5］。研究表明沉默AFP啟動子抑制肝癌細胞的增殖活性［6］。本實驗顯示：缺氧應激下人 HepG-2細胞AFP基因的表達上調，增殖活性增強，且兩者呈正相關；提示缺氧應激下HepG-2細胞增殖活性增強的機制之一是HepG-2細胞AFP基因的表達上調。

人ICAM-1（又名 CD54）基因長 15.5Kb，有7個外顯子和6個內含子，定位于染色體19p13.2-13.3區，編碼由4個前后排列的免疫球蛋白樣區域組成的糖蛋白，是介導細胞間識別和粘附的重要粘附分子［7］。曲增強等研究發現：ICAM-1基因是肝癌細胞生物學行為的標志物之一。ICAM-1高表達的肝癌細胞轉移能力增強，其可能的機制是：高表達ICAM-1的肝癌細胞通過LFA-1與浸潤性淋巴細胞緊密結合，肝癌細胞間粘附力降低，易于隨淋巴細胞的遷移脫離母瘤，與淋巴細胞結合的肝癌細胞在穿越血管壁時可以免受傷害，在血循環中易于形成栓子，逃逸免疫監視，易于在毛細胞血管內或淋巴竇滯留，形成轉移灶［8］。本實驗顯示：缺氧應激下人HepG-2細胞ICAM-1基因的表達上調，侵襲力增強，與 Indovina［9］結果一致。ICAM-1 基因表達與HepG-2侵襲力呈正相關；提示缺氧應激下HepG-2細胞侵襲力增強的機制之一是HepG-2細胞ICAM-1基因的表達上調。

AFP、ICAM-1基因表達正相關，與 Zhang等［10］研究結果一致，提示兩者可能在缺氧應激下HepG-2細胞增殖、侵襲能力增強中起協同作用，有待于進一步研究明確。AFP、ICAM-1基因是否是HIF-1的靶基因，有待于進一步研究證實。

［1］Jacques P，Frédéric D.Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression［J］.Nature，2006，441（7092）：437-443.

［2］盧根林，鄧勇，樊海寧，等.缺氧應激對HepG-2增殖活性和 HIF-1α、MMP-2 表達的影響［J］.青海醫學院學報，2007，28（4）：485-490.

［3］盧根林，鄧勇，樊海寧，等.缺氧應激對缺氧應激對人肝癌細胞粘附、侵襲和遷移能力的影響［J］.第三軍醫大學學報，2008，30（8）：721-723.

［4］Morkve O，Leaerum OD.Flow cytometry measurement of p21，p53 protein expression and DNA content in paraffin embedded tissues from bronchial carcinoma［J］.Cytometry，1991，12（5）：438-44

［5］Wang XW，Xie H.Alpha-fetoprotein enhances the proliferation of human hepatoma cells in vitro［J］.Life Sci，1999，64（1）：17-23.

［6］Gao P，Wang R，Shen JJ，et al.Hypoxia-inducible enhancer/alpha-fetoprotein promoter-driven RNA interference targeting STK15 suppresses proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells.Cancer Sci，2008，99（11）：2209-2217.

［7］Vassilis GG，Panayotis Z，Athanassios K，et al.p53 activates ICAM-1（CD54）expression in an NF-kB-independent manner［J］.The EMBO Journal，2003，22（7）：1567-1578.

［8］曲增強，吳孟超，謝天培，等.I型細胞間粘附分子在肝細胞癌中的表達及其意義［J］.中華病理學雜志，1997，26（2）：：82-84.

［9］Indovina P，Rainaldi G，Santini MT.Hypoxia increases adhesion and spreading of MG-63 three-dimensional tumor spheroids［J］.Anticancer Res，28（2A）：1013-1022.

［10］Zhang H，Miao Z，He Z，et al.The existence of epithelialto-mesenchymal cells with the ability to support hematopoiesis in human fetal liver［J］.Cell Biol Int，2005，29（3）：213-219.

Effects of hypoxia stress on expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell

LU Genlin1，DENG Yong2，YAN Xingjun1
（1.Yiwu Central Hospital，Zhejiang 322000，China；2.the Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810001，China）

ObjectiveTo investigate whether hypoxia stress regulates expressions of AFP and ICAM-1 in HepG-2 cell.MethodHepG-2 cells were cultured under hypoxia（5%O2，5%CO2and 90%N2）for 12，24 h or normoxia.The proliferation in HepG-2 cell was detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）.Cell invasion and migration assay was used to decide the invasion in HepG-2 cell.The expressions of AFP and ICAM-1 mRNA in HepG-2 cell were determined by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expression of ICAM-1 protein in HepG-2 cell was studied by flow cytometry assay.The expression of AFP protein in HepG-2 cell was determined by radio-immunity assay（RIA）.ResultWith the hypoxia time extending，the expressions of AFP and ICAM-1 gene were dramatically enhanced（P＜ 0.01）.ConclusionUp-regulation of AFP and ICAM-1 contributes to the enhancement of proliferation，invasion in HepG-2 cell by hypoxia stress respectively.

hypoxia stress；HepG-2 cell；AFP；ICAM-1

R364.4；R73-37

A

1672-0024（2012）01-0044-04

盧根林（1973-），男，浙江衢州人，碩士，主治醫師。研究方向：普通外科學

青海省衛生廳2006年指導性科研項目（編號：200601）