樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療腎細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究

韋思明，顏志中，周 劍

(1. 浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

·基礎(chǔ)與臨床研究·

樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療腎細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究

韋思明1，顏志中2，周 劍3

(1. 浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

目的：探討抗CD137抗體是否能加強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。方法將Renca腎癌細(xì)胞注入Balb/c小鼠皮下。3天后，小鼠被隨機(jī)分為4組，分別給予未治療、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療、抗CD137抗體治療、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療。腫瘤種植后20天，小鼠被處死，獲取脾臟分析T細(xì)胞活性。通過(guò)測(cè)量腫瘤大小來(lái)評(píng)定抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果相比于未治療，各種治療顯著增加了T細(xì)胞活性，抑制了腫瘤生長(zhǎng)，尤以聯(lián)合治療的作用為最強(qiáng)。結(jié)論聯(lián)合治療通過(guò)增加T細(xì)胞活性來(lái)提高抗腫瘤效應(yīng)。

樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗;CD137;腎細(xì)胞癌

Abstract: [Objective] To investigate whether anti-CD137 antibody can potentiate antitumor effect of dendritic cell (DC) vaccine. [Method] A renal cell carcinoma model was established by subcutaneous injection of Renca tumor cells into Balb/c mice. After 3 days, tumor-bearing mice were not treated or treated with DC vaccine, anti-CD137 antibody, or both combinations. Mice were killed on day 20 after tumor cell inoculation, and spleens were harvested for analysis of T cell activity. The antitumor effect was assessed by measuring tumor size. [Result] Compared with un-treatment, different treatments significantly increased T-cell activity, and inhibited tumor growth, with the highest effect in combination therapy. [Conclusion] Combination therapy can enhance antitumor effect by increasing T-cell activity.

Keywords: DC vaccine; CD137; renal cell carcinoma

樹(shù)突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞。利用樹(shù)突狀細(xì)胞制成的疫苗已被應(yīng)用于臨床治療腎細(xì)胞癌[1]。它通過(guò)激活腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，臨床緩解率僅為37%[1]。因此，如何加強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的治療效果是急需解決的重要課題。CD137(又稱4-1BB)是一個(gè)協(xié)同刺激分子，主要表達(dá)在激活的T細(xì)胞上[2]。抗CD137抗體與CD137的結(jié)合可以刺激T細(xì)胞活化[3]。在本研究中，我們探討了樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療腎細(xì)胞癌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡的Balb/c小鼠購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。腎癌細(xì)胞株Renca來(lái)源于美國(guó)細(xì)胞、菌種庫(kù)。重組鼠的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素4、腫瘤壞死因子α、干擾素γ購(gòu)于R&D Systems公司。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗CD11c、CD3單抗，以及藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD83、CD137單抗均購(gòu)自BD PharMingen公司。T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞分離試劑盒系Miltenyi Biotec公司生產(chǎn)。抗鼠CD137單克隆抗體購(gòu)于R&D Systems公司。鉻酸鈉來(lái)自PerkinElmer公司。檢測(cè)干擾素γ的試劑盒購(gòu)自BD PharMingen公司。

1.2 樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制作

取Balb/c小鼠的股骨，洗出骨髓細(xì)胞。骨髓細(xì)胞與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(10 ng/ml)、白細(xì)胞介素4(10 ng/ml)等一起培養(yǎng)。第二天棄懸浮細(xì)胞，隔日半量換液并加入新鮮細(xì)胞因子，第7天收獲未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。Renca腎癌細(xì)胞反復(fù)凍融后得到細(xì)胞溶解產(chǎn)物(即腫瘤抗原)。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與腫瘤抗原以1:3比例混合培養(yǎng)，并加入腫瘤壞死因子α(10 ng/ml)、干擾素γ(10 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟。負(fù)載腫瘤抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞就是成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，也就是樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。通過(guò)細(xì)胞表型分析來(lái)證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞。

1.3 樹(shù)突狀細(xì)胞表型分析

收獲未成熟和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗CD11c (樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)志)單抗、藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD83(樹(shù)突狀細(xì)胞成熟標(biāo)志)單抗染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD11c和CD83的表達(dá)。

1.4 T細(xì)胞表面CD137表達(dá)的分析

將Balb/c小鼠的脾臟制成細(xì)胞懸液，用T細(xì)胞分離試劑盒從脾細(xì)胞中分離出T細(xì)胞。純化的T細(xì)胞(1×105/孔)單獨(dú)培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，或者與樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗(1×104/孔)共同培養(yǎng)。3天后，收獲T細(xì)胞，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗CD3(T細(xì)胞標(biāo)志)單抗、藻紅蛋白標(biāo)記的抗CD137單抗染色，流式細(xì)胞儀分析CD137在T細(xì)胞上的表達(dá)。

1.5 小鼠腎腫瘤模型的制作及腫瘤治療

取Balb/c小鼠40只，將5×105的Renca腎癌細(xì)胞接種于每只小鼠的右腹皮下。3天后，小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。對(duì)照組：未經(jīng)任何治療。樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將1×106的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗注入小鼠左腹皮下。抗CD137抗體治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將100 μg抗CD137抗體注入小鼠腹腔內(nèi)。聯(lián)合治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將1×106的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗注入小鼠左腹皮下，在第6天與第13天，將100 μg抗CD137抗體注入小鼠腹腔內(nèi)。腫瘤種植后20天，處死小鼠，用卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑與橫徑，它們相乘的結(jié)果記錄為腫瘤大小。

1.6 鉻標(biāo)記釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒作用

以Renca腎癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，與鉻酸鈉混合培養(yǎng)1小時(shí)，以便靶細(xì)胞被標(biāo)記上鉻。腫瘤種植后20天，取對(duì)照組和不同治療組小鼠的脾臟。用CD8+T細(xì)胞分離試劑盒從脾細(xì)胞中分離出CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗以10:1的比例混合培養(yǎng)。5天后，致敏的CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞與鉻標(biāo)記的靶細(xì)胞混合培養(yǎng)，比例為100:1。4小時(shí)后取上清液，用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定鉻釋出量。通過(guò)公式：靶細(xì)胞溶解百分率=[(實(shí)驗(yàn)組鉻釋出量—自發(fā)鉻釋出量)/(最大鉻釋出量—自發(fā)鉻釋出量)]×100來(lái)評(píng)估CD8+T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。

1.7 干擾素γ水平的檢測(cè)

腫瘤種植后20天，取對(duì)照組和不同治療組小鼠的脾臟。用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒從小鼠脾細(xì)胞中分離出CD4+T細(xì)胞。將CD4+T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗以10:1的比例混合培養(yǎng)，24小時(shí)后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)上清液中干擾素γ的水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞特征

未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞CD11c和CD83的表達(dá)率分別為85.9%(即3.6%+82.3%)和3.6%；成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(也就是樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗)CD11c和CD83的表達(dá)率分別為87.1%(即71.5%+15.6%)和71.5%，見(jiàn)圖1。由此可見(jiàn)，未成熟和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞均高表達(dá)CD11c(樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)志)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞。成熟樹(shù)突狀細(xì)胞CD83(樹(shù)突狀細(xì)胞成熟標(biāo)志)表達(dá)率明顯高于未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。

圖1 流式細(xì)胞儀分析樹(shù)突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、CD83的表達(dá)

2.2 T細(xì)胞上CD137的表達(dá)

未受刺激的T細(xì)胞CD137表達(dá)率為0.9%；受樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗刺激后，T細(xì)胞上CD137的表達(dá)率明顯增加，為35.2%，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞上CD137的表達(dá)

2.3 各種治療方法對(duì)小鼠腎腫瘤生長(zhǎng)的影響

表1顯示：與對(duì)照組相比，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的腫瘤明顯縮小(t=13.15,P<0.0001;t=6.89,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的腫瘤明顯小于對(duì)照組、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t= 25.30,P< 0.0001;t= 10.58,P<0.0001;t=16.27,P< 0.0001)。

表1 各種治療方法對(duì)腫瘤大小、殺傷率及干擾素γ水平的影響

注：▲：與對(duì)照組比較P<0.0001;◆：與其他3組比較P< 0.0001

2.4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

表1顯示：與對(duì)照組相比，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的CD8+T細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞殺傷率明顯增加(t=15.24,P<0.0001;t=8.55,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的殺傷率明顯高于對(duì)照組、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t=19.16,P<0.0001;t=6.84,P<0.0001;t=11.37,P<0.0001)。

2.5 各種治療方法對(duì)干擾素γ水平的影響

表1顯示：與對(duì)照組相比，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的干擾素γ水平明顯提高(t=23.47,P<0.0001;t=17.93,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的干擾素γ水平明顯高于對(duì)照組、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t=24.95,P<0.0001;t=7.91,P<0.0001;t=13.54,P<0.0001)。

3 討論

腎細(xì)胞癌位居泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位(僅次于膀胱癌)。治療局限性腎癌的方法是行手術(shù)切除術(shù)，但這些患者中40%仍會(huì)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[4]。此外，30%患者在首次發(fā)現(xiàn)腎癌時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)外科手術(shù)已無(wú)能為力[5]。腎癌對(duì)化療和放療不敏感。因此，這類患者預(yù)后極差，平均生存時(shí)間只有9個(gè)月[1]。腎癌是一種免疫原性腫瘤，故免疫治療是目前治療腎癌的有效措施[6]。

腫瘤免疫過(guò)程中，抗原遞呈細(xì)胞處于中心環(huán)節(jié)。樹(shù)突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它捕獲加工處理腫瘤抗原并遞呈腫瘤抗原給CD4+、CD8+?T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化[7]。其中CD8+?T細(xì)胞活化后可以直接識(shí)別殺死腫瘤細(xì)胞，而CD4+?T細(xì)胞活化后，通過(guò)分泌干擾素、白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子來(lái)激活CD8+?T細(xì)胞，促進(jìn)CD8+?T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。使用樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療腎癌病人已成為近幾年的熱點(diǎn)。在國(guó)外14次臨床試驗(yàn)中，197名腎癌轉(zhuǎn)移患者接受了樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療，73人治療有效，占37%(73/197)[1]。其中4人腫瘤完全消失；8人腫瘤體積縮小50%以上，且沒(méi)有出現(xiàn)新的病灶；61人腫瘤體積縮小50%以下。整個(gè)治療過(guò)程中僅出現(xiàn)輕微的副作用，如：低熱，疲勞，腹瀉，感冒癥狀。以上臨床試驗(yàn)顯示：樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療腎癌是安全有效的，但它的臨床療效只有37%。如何提高疫苗的療效是一個(gè)研究重點(diǎn)。

CD137是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，它被表達(dá)在激活的CD4+和CD8+?T細(xì)胞上[2]。已有研究報(bào)道：抗CD137抗體與T細(xì)胞上CD137的結(jié)合可以刺激T細(xì)胞活化[3]。因此，我們的設(shè)想是：用樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療小鼠腎細(xì)胞癌，提高抗腎腫瘤功效。首先將樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗注入小鼠體內(nèi)，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗遞呈腫瘤抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化、表達(dá)CD137，隨后將抗CD137抗體注入小鼠體內(nèi)，抗CD137抗體與T細(xì)胞上的CD137結(jié)合，促進(jìn) T細(xì)胞進(jìn)一步活化，增加抗腎腫瘤功效。到目前為止，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)同類研究報(bào)道。我們的研究顯示：T細(xì)胞受到樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗刺激后上調(diào)了CD137的表達(dá)，這為抗CD137抗體的隨后應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。我們還發(fā)現(xiàn)：相比于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗或抗CD137抗體的單一治療，樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，這意味著聯(lián)合治療的協(xié)同抗癌效應(yīng)。此外，在聯(lián)合治療過(guò)程中我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)小鼠死亡及靈活性的改變，說(shuō)明聯(lián)合治療沒(méi)有明顯的毒性。

通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌試驗(yàn)可以檢測(cè)抗腫瘤免疫反應(yīng)。相比于單一治療，接受聯(lián)合治療的小鼠有更高的細(xì)胞毒性，這表明聯(lián)合治療增加了CD8+?T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。在細(xì)胞因子分泌試驗(yàn)中，聯(lián)合治療的小鼠顯示了更高的干擾素γ水平，這提示聯(lián)合治療提高了CD4+?T細(xì)胞分泌干擾素γ的活性，而干擾素γ能激活CD8+?T細(xì)胞的殺傷活性。綜合所有的結(jié)果，我們認(rèn)為聯(lián)合治療通過(guò)增加T細(xì)胞活性來(lái)提高抗腫瘤效應(yīng)。

總之，我們的發(fā)現(xiàn)首次證實(shí)：樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體能提高抗腎癌的效應(yīng)。這為臨床上治療腎癌提供了一條新的思路，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Experimentalstudyofrenalcellcarcinomatreatedwithcombinationofdendriticcellvaccinewithanti-CD137antibody

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3
(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China； 2. Red Cross Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

R737.11

A

1672-0024(2012)04-0047-04

韋思明(1971- ),男,浙江杭州人，博士，副教授,副研究員。研究方向：泌尿外科學(xué)

浙江省錢江人才計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(文件號(hào):浙人社發(fā)[2009]194號(hào))；浙江省教育廳科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):Y200805942)