厄貝沙坦聯合瑞舒伐他汀影響冠心病大鼠心肌及主動脈干s分泌型磷脂酶表達的實驗研究

郭麗蓉 孫常青

廈門大學附屬第一醫院干部科，福建廈門 361003

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）又稱缺血性心臟病，是因冠狀動脈供血不足，心肌急劇的、暫時的缺血與缺氧所引起的綜合征，常引發心絞痛、心肌梗死以致心力衰竭等的臨床病癥，嚴重威脅著人們的生命健康。冠心病的病理、生理過程，包括動脈粥樣硬化、斑塊破裂及局部血栓形成、冠狀動脈痙攣等。分泌型磷脂酶A2（typeⅡsecretory phospholipase A2，sPLA2）屬于鈣依賴的磷脂酶家族，有研究提示，sPLA2影響了動脈粥樣硬化過程，并在粥樣斑塊中有高度表達[1]。sPLA2-Ⅴ是sPLA2異構體之一，其在動脈粥樣硬化形成中的作用鮮有報道，本研究通過觀察厄貝沙坦聯合瑞舒伐他汀干預影響冠心病大鼠模型心肌及主動脈干sPLA2-Ⅴ的表達，以分析其在冠心病發病過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠50只，體質量180～220 g，由武漢大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物及主要試劑

厄貝沙坦（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批準文號：J20030113）；瑞舒伐他汀（阿斯利康制藥有限公司，批準文號：H20060406）；垂體后葉素注射液（上海第一生化藥業有限公司）；膽固醇（天津市博迪化工有限公司生產）；膽酸鈉（鄭州程達化工產品有限公司）；丙硫氧嘧啶（德國赫爾布蘭德大藥廠）；sPLA2-Ⅴ抗血清、sPLA2-Ⅴ單克隆抗體及檢測試劑盒（Boehringer Mannheim公司）；DAB（武漢子心生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 50只Wistar大鼠自由飲水進食，飼養于18～22℃的清潔級動物實驗室內，正常喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、厄貝沙坦組、瑞舒伐他汀組及厄貝沙坦聯合瑞舒伐他汀組（簡稱聯合用藥組），每組各10只。

1.3.2 動物造模 正常組以普通飼料喂養，其余各組大鼠每日以高脂飼料喂養（含2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、87.3%基礎飼料，于末次灌胃前72 h開始，每次灌胃30 min后，腹腔注射垂體后葉素30 U/kg，隔日1次，連續注射3次，建立冠心病心肌缺血模型[2-3]。正常組予以等容量的生理鹽水注射。

1.3.3 給藥方法 大鼠造模成功后，各組大鼠以相應的藥物給藥，厄貝沙坦組大鼠以厄貝沙坦 50 mg/（kg·d）灌胃；瑞舒伐他汀組大鼠以瑞舒伐他汀10 mg/（kg·d）灌胃；聯合用藥組予厄貝沙坦 50 mg/（kg·d）+瑞舒伐他汀 10 mg/（kg·d）灌胃；正常組和模型組予以每日2 mL生理鹽水灌胃，均持續12周。

1.4 檢測指標

1.4.1 采集標本 給藥12周后，各組大鼠禁食12 h，麻醉后迅速開胸剖取心臟和主動脈，于心尖部取適量的左心室心肌組織，將心肌組織和主動脈用預冷0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸濕后，放入4%多聚甲醛液中固定。

1.4.2 免疫組化檢測sPLA2-Ⅴ的表達 取上述心肌組織和主動脈標本，立即送冰凍切片，厚度10 μm，分別加入1∶100的sPLA2-Ⅴ抗血清及8.8 mg/L的sPLA2-Ⅴ單抗，室溫孵育2 h，PBS沖洗DAB顯色。sPLA2-Ⅴ陽性細胞呈棕紫藍色，位于細胞漿內，高倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野觀察細胞數不少于200個，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定[4]，①按照陽性細胞比例評分，1 分：＜10%，2 分：10%～50%，3分：＞50%；②按染色強弱評分，0分：陰性；1分：淡黃色染色；2分：中度黃色染色；3分：棕黃色染色?？偡?陽性細胞得分×染色強弱得分，總分＜3分為陰性，總分≥3分為陽性。以PBS代替一抗作為空白對照，采用試劑公司提供的陽性組織切片作陽性對照，正常心肌組織和主動脈標本作為陰性對照。

1.4.3 Western blot檢測sPLA2-Ⅴ表達水平 取上述心肌組織和主動脈標本，加入1 mL組織裂解液，于冰浴中勻漿20次，隨后轉入EP管中，4℃離心1 h，取上清，以微量Lowrry法測定sPLA2-Ⅴ蛋白含量。

1.5 統計學方法

所有數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達比較

見表1。

表1 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達比較（n=10）

2.2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達水平比較

見表2。

表2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達水平比較（±s，U/mL，n=10）

表2 sPLA2-Ⅴ在各組心肌組織及主動脈中的表達水平比較（±s，U/mL，n=10）

注：與正常組比較，★P ＜ 0.05，※P ＜ 0.01；與模型組比較，△P ＜ 0.05，▲P＜0.01；與厄貝沙坦組及瑞舒伐他汀組比較，●P＜0.05

組別 sPLA2-Ⅴ表達水平心肌組織 主動脈正常組模型組厄貝沙坦組瑞舒伐他汀組聯合用藥組1.51±1.23 6.43±1.55※4.25±0.87★△4.67±0.59★△2.04±1.11▲●2.06±1.17 7.81±1.96※4.13±1.02★△4.75±1.27★△2.88±1.64▲●

3 討論

SPLA2主要由血管壁平滑肌細胞與巨噬細胞等產生，在正常的動脈中，sPLA2主要分布于中膜的平滑肌細胞。在動脈粥樣硬化斑塊中，sPLA2主要與膠原纖維一起位于巨噬細胞集聚區、粥樣硬化的脂質核心區以及病變血管內膜的細胞外基質內。sPLA2-Ⅴ是近幾年發現的新的sPLA2的分型，其主要分布在人和鼠類的心臟及來源于巨噬細胞中。國外研究中發現sPLA2-Ⅴ可在動脈粥樣斑塊中檢測出來。

血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI）是一類抗高血壓和抗充血性心力衰竭藥，能擴張冠狀動脈，減輕心臟前后負荷，降低心肌耗氧，對抗心臟RAS的縮血管和水鈉潴留作用，中斷心力衰竭時的心臟惡性循環[4]。厄貝沙坦是ACEI類藥物，研究發現厄貝沙坦可降低sPLA2的表達及相應產生的脂質過氧化反應，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用[5]。由此推測厄貝沙坦也可能抑制sPLA2-Ⅴ的表達起到抗動脈硬化的作用。另外，有學者指出，在冠心病心絞痛擴張冠狀血管治療的同時，調解血脂，對改善血液流變性至關重要[6]。阿托伐他汀對sPLA2Ⅱα在動脈粥樣硬化大鼠表達的影響也有報道。但是有關于sPLA2-Ⅴ與瑞舒伐他汀藥物相關性的研究尚未報道。

本課題以厄貝沙坦、瑞舒伐他汀、厄貝沙坦聯合瑞舒伐他汀干預冠心病大鼠模型后，免疫組化結果顯示，正常大鼠心肌及主動脈組織中sPLA2-Ⅴ呈陰性表達，而冠心病模型大鼠sPLA2-Ⅴ均呈強陽性表達，而經過厄貝沙坦、瑞舒伐他汀干預后，sPLA2-Ⅴ表達減弱，但聯合用藥組表達最弱，接近正常組，說明厄貝沙坦及瑞舒伐他汀均可以抑制sPLA2-Ⅴ表達，但以聯合用藥效果最顯著。另外，Western blot蛋白定量結果也顯示，sPLA2-Ⅴ在模型組中高表達，顯著高于其余各組，但經過藥物干預后，厄貝沙坦、瑞舒伐他汀及聯合用藥組sPLA2-Ⅴ表達水平顯著下降，以聯合用藥組下降最顯著，說明厄貝沙坦聯合瑞舒伐他汀用藥下調sPLA2-Ⅴ表達效果顯著優于單一用藥。

綜上所述，貝沙坦聯合瑞舒伐他汀可能通過抑制心肌及主動脈干sPLA2-Ⅴ的表達起到抗動脈粥樣硬化治療冠心病作用，可作為心血管疾病高危人群的一級預防用藥。

[1]Liu PY，Li YH，Tsai WC，et al.Prognostic value and the changes of plasma levels of secretory type II phospholipase A2 in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention[J].EH J，2003，20：1824-1832.

[2]張明雪，常艷鵬，曹洪欣.溫陽活血中藥復方調控冠心?。ㄐ模╆柼撗鲎C大鼠血小板內受體、信號轉導的作用機制研究[J].中華中醫藥雜志，2008，23（6）：494-497.

[3]李昌，胡巍巍，高瑋，等.益氣化痰瘀方對冠心病大鼠的保護作用[J].河北中醫藥學報，2010，25（1）：3-5.

[4]朱明燕，柳景景，石雷.血管緊張素轉換酶抑制劑研究進展與臨床應用[J].中國醫藥導報，2011，8（1）：9-10.

[5]Burstein B，Nattel S.Atrial fibrosis：mechanisms and clinical relevance in atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol，2008，51：802-809.

[6]曹輝，盧長虹，聶廣鄰.血栓通治療冠心病心絞痛的臨床觀察[J].中國醫藥導報，2011，8（21）：14-16.