大孔吸附樹脂純化黃連總生物堿工藝研究

呂子明 劉文娟 王 永 劉曉燕 梁俊清 屠鵬飛

1.北京大學藥學院 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；2.北京以嶺藥業有限公司，北京 100027

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao、云連 Coptis teeta Wall.等的干燥塊莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]。黃連中的小檗堿、巴馬亭、黃連堿、小檗堿等生物堿是其發揮藥效的主要物質基礎。本實驗旨在優選出一種適合分離黃連總生物堿的大孔樹脂，并對優選出的大孔樹脂分離黃連總生物堿時的工藝條件及參數進行研究。

1 儀器與材料

UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorius BS 110電子天平；黃連（購于河北省安國以嶺飲片有限公司，經鑒定，符合《中國藥典》2010年版一部標準，產地：四川，批號：070401）；小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200208）；大孔吸附樹脂 S-8、DM130（三星樹脂科技有限責任公司），HPD-600、HPD-400A、HPD-700、AB-8、D101（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），D141、D4020（天津市波鴻建材化工樹脂有限公司），其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 上柱藥液的制備

按文獻[2]中優化好的提取工藝進行提取。取黃連飲片適量，加50%乙醇，溶劑用量8倍，提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加水定容至2 500 mL，抽濾，備用，即每毫升藥液相當于含30 mg生藥材。

2.2 含量測定

2.2.1 總生物堿的含量測定 依據文獻[2]，采用紫外分光光度法進行。

2.2.2 小檗堿的含量測定[2]依據文獻[2]，采用高效液相法進行。色譜條件：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，0.5 μm）；流動相：乙腈-磷酸水溶液緩沖鹽[磷酸-三乙胺-水（1∶2∶100）]（24∶76）；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；進樣量：5 μL。

2.3 大孔吸附樹脂的預處理

取各型號樹脂于95%乙醇漂洗干凈，浸泡24 h后，濕法裝柱，并用95%乙醇動態洗脫5倍樹脂體積，水洗至無醇味，依次用5%鹽酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和5%氫氧化鈉（浸泡6 h后，水洗至中性）處理，最后用95%乙醇動態洗脫至流出液加水（體積比1∶5）不變混濁為止，用水置換出乙醇后備用。

2.4 大孔吸附樹脂的篩選

分別量取25 mL各種樹脂，徑高比=1∶10，上樣濃度為30 mg/mL（藥材量/水液量），上樣流速為3 BV/h。檢測方法：按照文獻[1]中黃連藥材標準“鑒別”項下TLC法檢測漏液點，每5 mL流出液檢測一次，記錄上樣量，確定上樣終點。S-8、HPD-600、HPD-400A、DM130、D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020型樹脂的上液量分別為10、35、100、90、175、140、120、130、110 mL。結果表明，弱極性（HPD-400A、DM130）和非極性樹脂（D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020）用于黃連總生物堿的吸附效果較好，極性樹脂吸附效果差（S-8、HPD-600）； 因此選擇吸附量較高的 D-141、AB-8、HPD-700、D1014型樹脂進一步試驗。

對選出的 D-141、AB-8、HPD-700、D101 四個型號的樹脂進行考察。考察方法：采用動態法試驗，飽和吸附上樣；樹脂用量 25 mL，徑高比=1∶10；上樣濃度 30 mg/mL，吸附流速2 BV/h；上樣完畢后用2倍水洗柱；用70%乙醇（預試驗選定）作洗脫液，洗脫10倍量柱體積，洗脫的流速均為2 BV/h。收集各70%乙醇洗脫液、各吸附流出液、水洗液。

測定及分析結果顯示，測定上樣液、過柱后的流出液、70%醇洗脫液及水液中的總生物堿和小檗堿的含量，計算出各樹脂的最大吸附量及最大洗脫量，從而選出最佳樹脂，結果見表1。

表1 樹脂型號篩選結果

由表1結果表明，D-141的飽和吸附量最高，除D-141的洗脫率稍低外，其他3種樹脂的洗脫率差異無統計學意義，因此選用D-141為純化樹脂。

2.5 吸附過程參數考察

2.5.1 上樣濃度的考察 將不同濃度的樣品溶液（60、40、30、15 mg/mL）分別通過濕體積為25 mL的D-141樹脂柱，以2 BV/h的流速進行動態吸附。按照文獻[1]中黃連藥材標準“鑒別”項下TLC法檢測漏液點，每5 mL流出液檢測1次，記錄上樣量，確定上樣終點。結果上樣體積分別為75、140、165、250 mL； 總生物堿吸附量分別為 444.38、541.80、540.54、381.75 mg。由結果可知，當上樣濃度大于40或小于30 mg/mL時樹脂的吸附量變低，在30～40 mg/mL范內吸附量大，因此確定此范圍為上樣液濃度范圍。

2.5.2 吸附流速考察 選取 4個吸附速度， 即1、2、3、4 BV/h進行考察。考察方法：上樣濃度30 mg/mL，其他同上樣濃度考察試驗。結果測定及分析同“2.5.1”項下內容。結果是上樣體積分別為 175、175、175、165 mL。 結果表明，1、2、3、4 BV/h四個上樣速度下的樹脂吸附量相同，差別無顯著性。從吸附量穩定性及較短吸附時間的角度考慮，選擇2 BV/h的吸附速度上樣。

2.6 洗脫過程各參數考察

2.6.1 水洗（除雜）體積考察 進行三根柱平行試驗，按上述試驗確定的條件進行上樣和吸附；三根柱的水洗體積分別為1、2、3倍的柱體積，水洗流速為3 BV/h。測定上樣液、各水洗液中的總生物堿量，及上樣液和各水洗液的烘干后的干膏重；計算各倍數水洗液中的總生物堿量占上樣液總生物堿量的百分比，及水洗液中的總生物堿量占各自水洗干膏重的百分比。結果表明，3倍水洗時洗下的生物堿量大，除雜液中的生物堿含量超過了50%，而2倍水洗流失的生物堿量低，除雜液中的生物堿含量低于30%，因此選擇2倍水洗除雜。

2.6.2 洗脫乙醇濃度的考察 對 20%、30%、40%、50%、60%、70%六種乙醇濃度進行了考察。考察方法：平行進行6根柱的吸附洗脫；樹脂用量及徑高比同上樣濃度試驗；吸附、水洗工藝按優選工藝參數進行；醇洗速度為3 BV/h，醇洗體積為10倍柱體積。收集各醇洗液于500 mL量瓶中，加洗脫醇稀釋至刻度，搖勻。測定及分析結果顯示，測定各洗脫液中及上樣液的小檗堿含量、總生物堿含量及各洗脫液的干膏重，計算小檗堿、生物堿的洗脫收率及總生物堿在洗脫液干膏中的重量百分比。見表2。

小檗堿洗脫百分率=洗脫液中小檗堿的量/上樣液的小檗堿量×100%。

表2 洗脫乙醇濃度考察結果

干膏中生物堿百分含量=洗脫液中總生物堿的量/各洗脫液的干膏量×100%。

由表2結果可知，40%、50%兩濃度乙醇對總生物堿、小檗堿的洗脫率高，洗脫液的純度也適宜，選擇50%的乙醇為洗脫溶媒。

2.6.3 洗脫溶劑用量的考察

對4、6、8、10、12倍柱體積的50%乙醇用量進行了考察。考察方法：樹脂用量及徑高比同上樣濃度試驗；吸附、水洗工藝按優選工藝參數進行；醇洗速度為3 BV/h，進行12倍柱體積的洗脫，依次收集4、6、8、10、12倍時的洗脫液。結果測定及分析：測定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結果分別為93.15%、0.50%、0.14%、0.04%、0.02%。 由結果可知，4倍量50%乙醇洗脫可洗脫93%的上樣量，而后邊的2倍僅洗掉的量僅為0.5%，且后邊的8、10、12倍的洗脫量均依次遞減。因此選擇4倍柱體積洗脫。

2.6.4 洗脫流速的考察 對2、3、4 BV/h的流速進行考察。平行進行3根柱的吸附洗脫；樹脂用量及徑高比同上樣濃度試驗；吸附、水洗工藝按優選工藝參數進行；醇洗速度為依次為設定的3個流速，洗脫體積為4 BV，分別收集3種流速的洗脫液。結果測定及分析：測定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結果分別為見93.58%、93.39%、91.90%。由結果可知，2、3倍的洗脫流速時生物堿洗脫百分率較高，4倍稍低，從保證洗脫效果和縮短洗脫時間的角度考慮，選擇3 BV/h的洗脫流速。

2.6.5 徑高比考察 選擇 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 四種徑高比的樹脂柱進行考察。吸附、水洗、洗脫過程均按優選的工藝參數進行，收集各洗脫液。測定各洗脫液中及上樣液的總生物堿含量，計算各洗脫液中的生物堿占上樣總生物堿的百分比，結果分別為93.09%、94.53%、94.22%、95.87%。表明，隨著徑高比的變大，洗脫率有增大的趨勢，但差別不是很大，考慮生產上方便實用的原則，選擇適宜的徑高比為1∶8。

2.7 樹脂使用次數考察

具體的考察方法為每次的純化洗脫過程按純化工藝考察優化好的吸附、洗脫方法進行。樹脂用量為30 mL，收集各洗脫液。樹脂首次處理方法同“2.3”項，每次洗脫完畢后的樹脂處理方法為50%乙醇洗脫8倍體積，再用95%乙醇洗脫4倍體積。進行了10次試驗。結果測定及分析：測定上柱液、各次洗脫液中的總生物堿量，計算洗脫百分比。結果洗脫百分比分 別 95.21% 、95.29% 、95.62% 、96.78% 、95.38% 、95.46% 、94.96%、95.29、95.08、95.13%。樹脂重復使用 10 次，吸附、洗脫性能未有降低，說明樹脂應用于本品的純化具良好的耐用性。

2.8 驗證試驗

按上述所確定的吸附和洗脫條件，即平行制備3批樣品，測定總生物堿和小檗堿的解吸率以及總生物堿含量。總生物堿的解吸率分別為94.44%、94.76%、93.56%；小檗堿的解吸率分別為92.86%、93.48%、92.43%。醇洗物中總生物堿的含量為67.67%、68.01%、67.45%，平均值為67.71%。說明所得工藝穩定、可行。

3 討論

現有文獻報道多采用酸沉法純化黃連總生物堿，但是此方法在實際生產操作中對人體和環境有較大影響。近些年來，大孔樹脂在中草藥化學成分純化得到了廣泛的應用。作者在參考多篇文獻[3-8]的基礎上，進行了本文的實驗完善。確定大孔吸附樹脂純化黃連總生物堿的工藝即：選擇D-141大孔吸附樹脂，上樣藥液濃度為30 mg藥材/mL，徑高比為1∶8，吸附流速為2 BV/h，除雜溶劑為水，除雜體積為2 BV，除雜流速為1 BV/h，洗脫溶劑為50%乙醇，洗脫體積為4 BV，洗脫流速為3 BV/h。該工藝合理、可行，適合工業生產。

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