非小細胞肺癌中RECK和MMP-9的表達及其臨床意義

羅湘玉 鄭雪松 羅衛民

湖北醫藥學院附屬太和醫院胸心外科，湖北十堰 442000

肺癌是呼吸系統最常見的惡性腫瘤之一，占所有新發惡性腫瘤的12.4%，其死亡率位居惡性腫瘤的首位。其中以非小細胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）最常見（占所有肺癌的80%以上）[1]。腫瘤的侵襲性轉移是導致患者死亡的首要原因[2]。基序逆向誘導半胱氨酸豐富蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with kazal motifs，RECK）是Takahashi于1998年發現的一種抑癌基因，它能抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalproteinase，MMP）的活性，從而抑制腫瘤細胞的浸潤性生長以及血管生成。研究表明，多種惡性腫瘤組織RECK基因表達缺失，且其表達含量與腫瘤的侵襲轉移呈負相關[3]。本研究通過免疫組化等方法檢測NSCLC中RECK以及MMP-9的表達情況與臨床病理資料的關系，以進一步明確其在肺癌侵襲轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究組標本來自2008年2月～2011年10月我院心胸外科住院患者手術切除NSCLC組織66例，所有患者擁有完整的隨訪資料，在手術前均為接受放療、化療等抗腫瘤治療。其中男42例，女24例，年齡37～71歲，中位年齡62歲。所有標本均經病理學證實：鱗癌36例，腺鱗癌30例。中分化以上40例，低分化26例。根據UICC分期標準，Ⅰ期21例，Ⅱ期18例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例。其中淋巴結轉移39例，無轉移者27例。對照組標本為同期我院30例炎性假瘤患者。男17例，女13例，年齡34～69歲，中位年齡55歲。

1.2 主要試劑

兔抗人RECK以及MMP-9兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruze（北京中山金橋）。DAB顯色試劑盒購自福建邁新公司。其余試劑均為分析純產品，主要購自上海生工和索萊寶公司。

1.3 免疫組化方法

所有石蠟標本切成4 μm厚度后放入70℃烤箱中烘烤3 h，經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，將切片置于檸檬酸液中也中進行抗原修復，并于室溫自然條件下冷卻，PBS洗滌3次后，用3%H2O2溶液室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS洗滌后加入相應抗體孵育過夜，隨后加入通用型聚合物輔助劑室溫孵育30 min，洗滌后，加入HRP標記IgG二抗孵育30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水干燥，中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。

1.4 結果判斷

高倍鏡下選取5個視野，根據陽性細胞的比例及顏色深淺進行判定：①陽性細胞數目：無陽性細胞計0分；0＜陽性細胞數≤25%計1分；50%≥陽性細胞數＞25%計2分。②表達強弱度：陽性信號強烈，細胞呈棕褐色計3分；陽性信號中等，棕色，細胞呈顆粒狀計2分；信號較弱，細胞呈淡棕色或細顆粒狀，計1分；無陽性信號計0分。以對應上兩項計分相加，0 分：（-），1～3 分：（+），4～5 分：（++），6～7 分：（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。MMP-9、RECK陽性表達率和臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。RECK與MMP-9的相關性采用Spearman等級相關檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-9和RECK在NSCLC中的表達

RECK和MMP-9主要表達與細胞漿中，為不同程度的淡黃色或棕褐色顆粒，散在或片狀分布。在NSCLC中，MMP-9和RECK的陽性表達率分別為75.6%（50/66）和40.9%（27/66）。而在正常肺炎性假瘤組織中，兩者表達率分別為33.3%（10/30）和 93.3%（28/30）。 經統計學分析，MMP-9 在 NSCLC中的表達水平明顯高于肺炎性假瘤患者，而RECK的表達水平較低（P＜0.05）。 見表1。

表1 NSCLC中RECK及MMP-9表達情況（例）

2.2 RECK與NSCLC臨床病理特征之間的關系

RECK與患者原發腫瘤的大小、病理學類型以及分化程度之間差異無統計學意義（P＞0.05），但與淋巴結轉移及TNM分期相關（P＜0.05）。在無淋巴結轉移的患者當中，RECK的表達顯著高于淋巴結轉移患者，Ⅰ～Ⅱ期患者RECK表達高于Ⅲ～Ⅳ期患者（P＜0.05）。見表2。

2.3 MMP-9與NSCLC臨床病理特征之間的關系

MMP-9的表達與原發腫瘤大小、病理學類型以及分化程度之間差異無統計學意義（P＞0.05）。在有淋巴結轉移的患者當中，MMP-9表達顯著高于無淋巴結轉移患者，Ⅰ～Ⅱ期患者MMP-9表達低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P＜0.05）。見表3。

表2 NSCLC患者中RECK的表達與臨床病理特征的關系

表3 NSCLC患者中MMP-9的表達與臨床病理特征的關系

2.4 RECK與MMP-9表達的相關性

經 Spearman相關性分析，r=-0.517，P＜0.01。 表明RECK與MMP-9的表達呈明顯的負相關。見表4。

表4 RECK與MMP-9的相關性分析

3 討論

肺癌細胞浸潤性生長和轉移，首先必須具備分解基底膜以及細胞外基質（ECM）的能力。在眾多的MMP當中，以MMP-9最重要。它不僅可降解ECM，而且能促進血管的發生。生理條件下，組織中MMP-9表達量極低，而在多種腫瘤細胞中，其表達量顯著增高，且與侵襲力呈正相關。Zhang等對不同分期的NSCLC患者體內MMP-9 mRNA表達水平進行了研究，結果顯示，Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-9 mRNA水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者，MMP-9陽性者其5年生存率明顯低于MMP-9低表達者[4]。Stenvold等采用免疫組化等方法檢測了325例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者MMP-9的表達情況，結果顯示NSCLC患者中MMP-9表達顯著增高，并且MMP-9的高表達可能與預后不良密切相關[5]。因此，Sienel等認為MMP-9的表達水平可作為預測NSCLC術后預后的重要指標[6]。本實驗研究結果表明，MMP-9在正常肺炎性假瘤中的表達較低，而在非小細胞腺癌中表達較高，其表達水平與腫瘤大小以及分化程度無關。提示MMP-9的表達可能與肺癌的侵襲過程有關。MMP-9的異常增高有利于腫瘤細胞從原發部位脫落并隨血液和（或）淋巴循環形成新成新的轉移灶。MMP-9對ECM的反復降解，又有利于新發腫瘤病灶中淋巴管的產生，從而形成惡性循環[7-8]。

RECK作為新發現的MMP-9的抑制物，可有效抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移。在本實驗中，筆者首次揭示了RECK基因的表達與非小細胞癌以及淋巴結轉移之間的關系。其中在肺癌組織中，RECK的陽性率僅40.9%，明顯低于肺炎性假瘤，與國外研究結果一致[9]。但不同分化的肺癌組織中RECK陽性率差異無統計學意義，表明其與細胞分化無關。此外，RECK的陽性表達率隨臨床分期的增加而降低，提示RECK的正常表達對肺癌的發生發展起一定程度的抑制作用。因此檢測NSCLC患者體內RECK的表達水平可能對其預后的評估具有一定的臨床意義。本研究還證實，RECK的陽性率還與淋巴結轉移有關，其機制可能與Kras的突變有關。Pesta等[10]發現，RECK的低表達可能與其啟動子區域的甲基化有關。本研究還對RECK與MMP-9的表達情況作了Spearman分析，結果證實RECK與MMP-9的表達呈負相關。這再次說明RECK基因通過抑制MMP-9而發揮抑制腫瘤轉移到作用[11]，因此，RECK、MMP-9的檢測能反映肺癌發生淋巴結轉移，并有望成為肺癌預后評估的有效指標及新的治療靶點。

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