臍帶間充質干細胞移植治療肌萎縮側索硬化癥的療效分析

李 敏 滑蓉蓉 于愛學 張芳芳 代廣輝 王曉東 程洪斌 安沂華

武裝警察部隊總醫院神經干細胞移植科，北京 100039

肌萎縮側索硬化（ALS）是一種病因未明、選擇性侵犯脊髓、腦干及皮層運動神經元的進行性變性疾病。患者從最初發現癥狀開始，平均僅能存活3～5年。發病以中老年人為主，青少年少見，平均發病年齡約59歲，發病率在1/10萬～3/10萬，有家族性傾向[1]。因為該病的病因是多因素的，至今不是很清楚，因此當前無實質性減緩疾病進展的治療手段。由美國FDA獲準在臨床應用的利魯唑（Riluzole），是一種興奮性氨基酸受體阻滯劑，對延長患者存活期有一定作用[2]。但是并沒有逆轉患者病情的作用。

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，目前研究較多的干細胞種類包括胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞和誘導產生的多能性干細胞等。由于臍帶間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，且具有獲取簡便、無倫理學爭議、增殖力強、來源廣泛、不導致免疫排斥等優點[3]，成為現在研究的熱點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對2005年1月～2008年12月于我科就診接受干細胞治療的99例MND患者進行分析，其中男64例（64.6%），女35 例（35.4%）。年齡 32～73 歲，平均（52.9±9.3）歲。 病程 4～120個月，平均病程（26.0±19.5）個月。依據1994年世界神經病學聯盟在西班牙EI Escorial會議上制定的肌萎縮側索硬化（ALS）診斷標準[4]，本組均為確診ALS。

1.2 評分

1.2.1 ALSFRS（A）評分 ALSFRS評分包括語言、唾液分泌、吞咽、書寫、切斷食物和使用餐具、穿衣和衛生保健、在床上翻身和整理衣物、行走、攀登樓梯以及呼吸共十個項目，總分0～40分，分值越低，神經功能損害越嚴重。但是此項評分方法的缺點是對于延髓功能的評測指標太少，只有一項指標。

1.2.2 Plaitaks（P）評分以及改良Plaitaks評分 由于ALSFRS評分方法存在不足，因此本項課題同時又使用另一種臨床評價方法——Plaitaks評分，此項評分在詳細地評價四肢肌力的同時，還對延髓功能做了專門的評價。該項評分方法的滿分為165分，分值越高神經功能損傷越輕，但是通過臨床驗證，我們發現此方法還存在著不足——缺少對軀干活動以及呼吸功能的評分，因此本課題在此基礎上稍加改良，以便達到更好地對ALS運動功能進行評價的目的。改良的Plaitaks（滿分204分）評分在原有評分基礎上，增加了兩個方面的評價：①在脊髓功能項中增加了對雙側的頸部屈曲、頸部伸展和聳肩的運動功能評價，每項評定采用6級分法；②延髓功能中增加了咀嚼運動。除了脊髓功能和延髓功能兩項外，還增加了一大項——呼吸肌力量，包括吸氣運動和呼氣運動（正常3分，輕度損傷2分，中度損傷1分，嚴重損傷0分）。

1.3 干細胞治療

1.3.1 干細胞來源 采自健康的正常孕周的剖腹產產婦的臍帶，孕婦術前各項檢查包括：血常規、尿常規、凝血功能、肝功能、腎功能、血糖、血脂檢查結果都正常；梅毒和艾滋病抗體陰性；無甲、乙、丙型肝炎；無家族性、遺傳性疾病病史。

1.3.2 臍帶間充質干細胞的培養過程 具體方法：經孕婦簽署書面同意書后，于剖腹產手術中取臍帶約10 cm，無菌條件下分離、培養、傳代。收集第4～6代的細胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細胞儀進行鑒定，然后用于移植。

1.3.3 間充質干細胞應用到臨床的標準 應用到臨床之前，首先對干細胞進行各種檢測，包括：①細胞形態學檢測；②細胞表面標記檢測；③無菌檢測；④支原體檢測；⑤內毒素檢測：鱟試劑檢查法結果陰性（根據2000年版細菌內毒素檢查法）。

1.3.4 臨床治療過程 術前收集干細胞并用生理鹽水將其制備成2 mL細胞懸液，細胞濃度為0.5×107/mL，將其吸入1 mL注射器。常規進行腰椎穿刺，進入蛛網膜下腔后，緩慢采集2 mL腦脊液，然后將2 mL細胞懸液緩慢注入。患者去枕平臥6 h。監測患者血壓、心率、血氧、呼吸24 h。1周以后重復1次，總共進行4次。

1.4 統計學方法

應用軟件SPSS 11.5進行統計分析，經正態性檢驗，治療前后ALSFRS評分、原始Plaitaks評分以及調整Plaitaks評分數據符合正態分布，治療前后評分比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般病例資料結果

在99例確診ALS患者中年齡最小的32歲，最大的73歲，平均（52.9±9.3）歲，且住院時的病程為 4～120 個月，平均病程（26.0±19.5）個月。這比國際上公布的平均發病年齡（55歲）要早。另外性別比例男64例（64.6%），女35例（35.4%），男性的發病率明顯高于女性。

2.2 流式細胞學檢測干細胞表面標記物

CD90+100%，CD44+99.82%，CD73+100%，CD105+99.95%，CD45，CD34，CD19，CD11b 表達率小于 2%。

2.3 干細胞治療結果

99例患者在移植前以及移植后分別進行A評分，P評分以及改良的P評分，三種評分結果在應用統計分析后結果P值均＜0.001（表1），說明干細胞治療 ALS是有效的，并且統計學上有顯著意義。

表1 干細胞治療ALS前后評分統計結果

2.4 隨訪結果

99例ALS移植治療后隨訪半年，失訪19例（19.2%），死亡 10例（10.1%），癥狀改善25例（25.3%），病情進展 45例（45.5%）。在有效隨訪的人群中改善率為25/80（31.3%）。隨訪半年～1年，患者死亡 25例（25.3%），癥狀改善 4例（4.0%），病情進展41例（41.4%）。隨訪 1～2年，患者死亡 28例（28.3%），癥狀改善 1例（1.0%），病情進展 16例（16.2%）。

3 討論

MSC用于臨床應用研究的種類主要是骨髓間充質干細胞和臍帶間充質干細胞，這兩類細胞都具有MSC共同的特點即低免疫源性。與成體階段與多種細胞共同生存的骨髓間充質干細胞相比，臍帶間充質干細胞發育階段更早，其所生長的組織環境更為單純，因此便具有更強的增殖能力與分化能力，更低的免疫源性，更加強大的分泌因子能力，加之大量的細胞來源、方便的提取提純以及易于體外培養等特性，是選擇其為細胞來源的主要原因。

Mazzini等[5]應用骨髓來源的間充質干細胞移植治療ALS，將培養好的干細胞懸浮于自體腦脊液中，外科暴露胸段脊髓，在平T7～9水平脊髓局部移植。分別在移植后3～6個月行MRI檢查，沒有發現脊髓結構改變和異常細胞增殖，且一半的患者的下肢肌力減弱的趨勢漸趨緩和。而且長期觀察已經證實BMSC的培養擴增和移植入人脊髓是安全的，在ALS患者可以耐受[6]。Karussis和他的同事在經過大量的臨床前研究后，利用靜脈或者鞘內注射MSCs治療ALS或者多發性硬化[7]，證實了兩種方法治療神經系統變性病是安全有效地。因此本課題從安全角度考慮下選擇了使用腰椎穿刺蛛網膜下腔注射的方式移植干細胞，操作簡單、安全、創傷小。

本課題的研究結果發現，患者接受干細胞治療后癥狀明顯改善，且移植前后的評分統計學上有顯著差異，說明干細胞治療ALS是有效的，通過臨床觀察，治療后患者的改善主要是①肌肉力量的增加；②四肢肌張力下降；③肌束震顫次數明顯減少；④言語及吞咽功能明顯好轉?？紤]到MSCs發揮作用的機制主要是①神經替代作用；②神經營養作用；③激活自身干細胞。人們利用添加某種遞質（如神經營養因子）或者與人類神經元共培養的方法誘導出神經樣細胞，并且證明誘導的神經樣細胞存在某些神經功能[8]。GDNF具有與運動神經元高親和性的特性，能夠預防神經元的死亡。Suzuki等[9]證明在大鼠身上證實了移植入肌肉的hMSCs能夠在肌肉中存活，并且可以不斷分泌GDNF，給予肌肉、神經肌肉接頭持續的神經營養支持，從而減少ALS大鼠脊髓運動神經元的丟失，改善生存以及神經功能。接受干細胞移植的部分ALS患者最短在移植后4 h即有明顯的神經功能恢復，有研究證實ALS患者在運動神經元以及神經膠質細胞受損之前，伴隨神經肌肉接頭受損同時，有60%前根受損[10]。因此考慮干細胞如此早的發揮神經修復作用可能與干細胞分泌神經營養物質有關。

在治療結束后的半年隨訪結果：失訪19.2%，死亡10.1%，癥狀改善25.3%，病情進展45.5%，在有效隨訪的人群中改善率為25/80（31.25%）?？梢钥闯龃蟛糠只颊甙Y狀出現反復，病情復又進展。這說明干細胞治療ALS在短期內確實有效，但是長期療效還有待進一步探討，從隨訪情況來看有效期維持在3～6個月，大部分患者在干細胞治療半年后又開始出現惡化趨勢。這是否從臨床方面說明了干細胞發揮作用的機制是神經營養或者免疫調節呢，亦或是干細胞在體內的生存期大概在半年左右呢，還需要進一步的實驗證實。

從安全角度來看，所有的患者住院20余天期間沒有發現任何不適癥狀。隨訪中發現大部分的死亡患者死因為呼吸衰竭，其次為飲食導致的窒息。沒有發現任何因為免疫排斥或者腫瘤導致的死亡。說明了干細胞移植治療ALS是安全的。

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