乙型肝炎病毒X蛋白、雄激素受體及p53蛋白在肝細胞癌中的表達及意義

陳 江 楊柳明 趙延龍 崔 彬 王麗紅

廣東省廉江市人民醫院肝病中心，廣東廉江 524400

乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白（HBx）是一個多功能調節蛋白，對于啟動和維持HBV的復制是必須的，是HBV自然感染過程中的關鍵的調節因子；是HBV感染誘發肝細胞癌變的主要蛋白，故亦稱癌蛋白。HBV相關肝癌多發生于男性的原因是和雄激素及雄激素受體（androgen receptor，AR）有關[1]。肝癌的發生常伴抑癌基因p53的改變[2]。本研究采用SP免疫組化方法檢測三者在HBV相關肝癌中的表達及關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年2月～2010年5月廉江人民醫院手術切除并經病理組織學檢查確診為HCC且有完整隨訪資料的標本58例，患者均未經過任何抗腫瘤治療，HbsAg均為陽性。男46例，女12例；年齡23～86歲，中位年齡60歲；47例AFP≥400μg/L，11例 AFP＜400μg/L，39例腫瘤直徑≥5cm，19例＜5 cm，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期46例。Edmondson-Steiner分級：Ⅰ～Ⅱ級6例，Ⅲ～Ⅳ級52例。伴有門靜脈癌栓18例，腹腔淋巴結及遠處轉移9例。

1.2 試劑

HBx蛋白抗體及鼠抗人p53單克隆抗體及S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兔抗人雄激素受體抗血清購自Sigma公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用SP免疫組織化學法檢測HBx、AR及P53蛋白的表達，按試劑盒說明書操作步驟嚴格進行操作。用已知陽性組織切片做陽性對照，以PBS液做陰性對照。

1.4 結果判斷

參照蔣成英等[3]的判斷標準。陽性細胞計數：隨機選擇5個高倍視野，染色細胞＜5%計0分，5%～24%計1分，25%～49%計2分，50%～74%計3分，≥75%計4分。染色強度：細胞不著色計0分；淺黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。染色強度得分與陽性細胞計數得分相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），9～12 分為強 陽性（+++）。

1.5 統計學方法

根據實驗資料的性質，采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，對所得資料進行χ2檢驗，相關分析采用Spearman等級相關系數，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC中HBx、AR及P53的表達

少數定位于細胞核（圖1），AR陽性表達定位于細胞核（圖2），P53陽性表達定位于細胞核及核膜上（圖3）。HCC和癌旁組織中 HBx及 AR的表達率為 63.8%（37/58）、58.6%（34/58） 及 62.0%（36/58） 和 20.9%（12/58）、27.6%（16/58）及8.6%（5/58），差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。

圖1 HBx陽性表達（SP×200）

圖2 AR陽性表達（SP×200）

圖3 P53陽性表達（SP×200）

2.2 HCC中HBx、AR及P53表達的相關性

HBx陽性和HBx陰性的HCC組織中AR的表達率分別為 72.3%（27/37）、83.8（31/37）和 33.3%（7/21）、23.8（5/21），在HCC組織中HBx表達與AR表達正相關（r=0.453 2及r=0.475 4，P ＜ 0.05）。

2.3 HBx、AR表達與臨床病理特征的關系

HBx染色的陽性率與AFP水平和分化程度相關；AR染色的陽性率與性別及腫瘤直徑相關，p53染色的陽性率與TNM分期相關。見表1。

3 討論

流行病學研究顯示全世界80%以上的HCC與慢性乙型肝炎或丙性肝炎有關，由于病毒流行的地域不同，中國的HCC大部分是HBV相關性的，HBV相關HCC的顯著特點是男性多發，與HCV感染者相比HBV感染者更容易發生HCC，研究者發現HBV的X蛋白與宿主肝細胞AR信號通路系統的相互作用是HBV相關HCC高發于男性的主要原因[4]。

HBx蛋白是多功能病毒調節因子，調控轉錄、細胞對基因毒性壓力的應激反應、蛋白降解及信號通路，是肝癌發生過程中最重要的病毒因子[5]。在肝癌細胞株及HBx轉基因小鼠的研究已經證明HBx可以增加AR的轉錄活性，離體研究表明HBx可以增加AR蛋白質的水平并且通過其蛋白體酶活性增加AR的穩定性。AR信號系統會增加肝細胞癌變的危險，AR可以被認為是一種癌基因，宿主細胞在癌變過程中AR轉錄活性的增加是主要原因，Zhu等[4]采用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、蛋白印記及免疫組織化學染色等方法檢測HBV相關HCC及HBV陰性HCC中的AR表達發現，HBV相關HCC組織中AR的mRNA及蛋白表達均明顯高于HBV陰性的HCC組織中的表達，轉染HBx的L02及BEL-74004肝癌細胞株AR的表達明顯升高，提示HBx通過刺激轉錄增加AR的表達。與本試驗的結果相仿，表明AR在HBV相關HCC的發生中起作用。

近幾年致癌作用中的表觀遺傳學改變備受關注，甲基化是表觀遺傳學改變的一種重要基因修飾方式，HBx蛋白是人肝細胞內主要的甲基化改變調節因子，在HBV誘發的肝癌發生早期HBx通過激活DNA甲基轉移酶基因使抑癌基因啟動子甲基化抑癌基因低表達。AR啟動子CpG島DNA的甲基化使AR在前列腺癌細胞及組織內的表達下降，而在HBV相關HCC組織中AR表達不伴其啟動子甲基化，AR的甲基化狀態與DNA甲基轉移酶（DNMT）水平無關，HBV相關HCC組織中AR的表達及甲基化與前列腺癌不同，是組織特異性的[4]。

P53是最強的腫瘤抑制因子，在細胞應對各種應激反應時，P53相應的會誘導細胞周期阻滯或發生凋亡。在非應激狀態下，P53受其負反饋調節因子MDM2（murine double mimute 2）蛋白的嚴密調控，P53激活MDM2基因的轉錄反過來MDM2蛋白又抑制P53的轉錄活性。在這種反射弧的調節下，P53及MDM2平時都維持較低水平，在應對應激時細胞內的P53水平增加導致下游靶基因的激活及P53通路系統的功能激活，發生細胞周期阻滯及凋亡[6]。P53對AR也具有調節作用，盡管P53控制AR的精確機制尚不明確，但P53基因的過表達通過抑制AR依賴基因的表達可以明顯降低AR的功能[7]。生理水平的P53對雄激素信號系統有保護作用，當P53與AR基因的啟動子穩定結合后雄激素信號系統的功能明顯減弱，P53的負性調節因子MDM2也可以通過泛素依賴的蛋白降解作用調節AR蛋白水平[6]。

表1 臨床病理特征與肝癌組織中HBx、AR及p53陽性表達的關系[n（%）]

HBV感染及男性是HCC發生的兩個高危因子，HBV的HBx蛋白是肝癌發生過程中的始動因子，參與肝癌發生的一系列改變，包括AR系統的活化。雄激素及AR信號系統是宿主應答HBx作用的信號系統之一，另外，HBx可以導致P53通路介導細胞周期阻滯及凋亡抑制。本試驗研究顯示HBx表達與AR及P53顯著中相關，該結果印證了三者的關系。三種蛋白在不同臨床病理特征的HCC中的不同表達，提示三者在HCC發生發展的不同階段起不同作用。國際多中心隨機臨床試驗表明抗雄激素治療對HCC療效不明顯，臺灣學者Ming等[8]動物試驗研究發現二甲氧基姜黃素（ASC-J9）可拮抗和降解雄激素受體，以抑制雄激素受體（AR）的表達，使AR的量減少，從而抑制HBV轉基因小鼠肝癌細胞的增殖。MDM2拮抗劑Nutlin-3α是一種小分子化合物通過干擾P53-MDM2反射弧激活p53通路使野生型p53表達升高癌細胞凋亡，是一種增加野生型p53活性的抗治療藥物[6]，本試驗肝癌組織中p53的陽性率為62.0%（突變型），p53突變與肝癌發生顯著相關。肝癌是一種治療手段有限的腫瘤，本試驗研究表明HBx、AR及p53在肝癌發生發展中作用重要，針對這三個“靶點”綜合治療方案，如抗病毒（降低HBx水平）治療加拮抗和降解雄激素受體治療（ASC-J9）加MDM2拮抗劑可能成為HCC治療的一種新思路。

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