Src酪氨酸激酶抑制劑對人胃癌細胞SGC7901上皮-間質轉變相關基因的作用及機制

林 偉，陳金坤，邱仙土，陳建新

（福建省莆田學院附屬醫院普通外科，莆田351100）

近年來，腫瘤上皮間質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和腫瘤浸潤及轉移的關系備受關注。EMT是指上皮細胞與周圍間質細胞相互作用，E-鈣黏素(E-cadherin)等細胞粘附分子表達減少，細胞間連接解體，細胞分散，角蛋白為主的細胞骨架逐漸轉變為波形蛋白為主的細胞骨架，導致細胞骨架重排，纖粘連蛋白表達增加，細胞粘附能力下降、運動能力增強，逐漸喪失上皮細胞極性獲得間質細胞特性的過程[1]。EMT可使沒有侵襲的腫瘤細胞獲得浸潤能力，促進腫瘤形成局部浸潤和遠端轉移。胃癌是最常見的消化系統腫瘤之一，早期發現率低，確診時多數已出現了腫瘤轉移，因此抑制腫瘤轉移是治療胃癌的關鍵。Src酪氨酸激酶已經被證明與腫瘤轉移密切相關，本文旨在探討Src酪氨酸激酶抑制劑對人胃癌細胞SGC7901上皮間質轉變的抑制作用及機制，為臨床應用Src酪氨酸激酶抑制劑治療胃癌轉移提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人胃癌細胞SGC7901購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉購自AstraZeneca公司，化學發光HRP底物購自Millipore公司，real-time PCR系統購自ABI公司，雙熒光報告基因檢測系統購自Promega公司。

1.2 細胞培養 SGC7901細胞于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下，以RPMI1640培養液（含10%小牛血清）中培養及0.25%胰酶-EDTA消化，采用對數生長期細胞進行實驗。

1.3 4-苯胺喹唑啉對細胞生長的抑制作用 細胞2×104/mL接種于96孔板，每孔0.1mL，溫育24 h后，分別加入不同濃度的4-苯胺喹唑啉，分別設置細胞對照及空白對照，每組樣本設5個復孔，溫育48 h后，加入MTS，培養2 h后測定吸光度值（490 nm）。

1.4 4-苯胺喹唑啉對p-Src、E-cadherin及β-連環蛋白（β-catenin）表達的影響 將細胞接種于直徑10 cm培養皿上，待細胞長滿培養皿的90%時，給予不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下溫育6 h，用預冷的PBS漂洗2次，立即加入300μL細胞裂解液，4℃下14 000×g離心5min，取上清液，用Bradford蛋白分析試劑測量所提取蛋白的濃度。

取100μg蛋白樣品行SDS-PAGE分離蛋白,隨后電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原1 h，加入兔抗人Src酪氨酸磷酸化特異性多克隆抗體1∶500稀釋（Millipore），鼠抗人E-cadherin 單克隆抗體 1∶500 稀釋（Santa Cruz），鼠抗人 β-catenin單克隆抗體 1∶500稀釋（Santa Cruz），1∶200稀釋的鼠抗人 β-actin單克隆抗體（Sigma）作為內對照，4℃反應過夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下反應1 h，洗膜后DAB顯色，將條帶結果進行掃描。

1.5 4-苯胺喹唑啉對E-cadherin及 β-catenin mRNA表達的影響 將細胞3×105/mL接種于6孔板，用不同濃度的Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下溫育6 h，收集細胞后用TRIzol抽提總RNA，并將GAPDH作為內參照，用以下引物序列擴增：E-cadherin上游引物序列：5′-GTCACTGACACCAACGATAATCCT-3′，下游引物序列：5′-TTTCAGTGTGGTGATTACGACGTTA-3′；β-catenin 上游引物序列：5′-GCTCTTCGTCATCTGACCAGCC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAAGTTC ACAGAGGACCC-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′；下游引物序列：5′-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3′。擴增條件為：預變性94℃，5min，共進行35個循環擴增，每一循環包括 95 ℃ 5 s、65 ℃ 35 s。

1.6 4-苯胺喹唑啉對Snail啟動子活性的影響 將SGC7901細胞3×105/mL接種于6孔板，用不同濃度4-苯胺喹唑啉（5、10μmol/L）溫育 6 h，應用 LipofectamineTM2000轉染pSnail-luc和CMV啟動子海腎

熒光酶內標報告基因載體24 h后，用雙熒光酶測定試劑盒檢測Snail的轉錄活性，計算螢火蟲熒光酶激發光子數目和海腎熒光酶激發光子數目的比值。Snail啟動子序列為：Sense ：5′-CCAGATCTCAAAGCACACTTCCCTTTGCATTG-3′； Antisense：5′-GGGCCATGGTGGTCGAGGCACTGGGGTC-3′。

1.7 統計學處理 數據采用SPSS 11.0統計分析軟件進行方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞生長的抑制作用 4-苯胺喹唑啉在10μmol/L時對SGC7901細胞無明顯毒性，超過此濃度后，4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，因此選擇5μmol/L及10μmol/L 4-苯胺喹唑啉進行研究。

2.2 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞Src酪氨酸激酶磷酸化的抑制 如圖1所示，4-苯胺喹唑啉可顯著抑制SGC7901細胞中Src蛋白的自主磷酸化（p-Src），且呈現劑量依賴性。

2.3 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞中E-cadherin及β-catenin表達的影響 如圖2所示，4-苯胺喹唑啉可增加SGC7901細胞E-cadherin在mRNA及蛋白水平表達，抑制β-catenin在mRNA及蛋白水平表達，且呈現劑量依賴性。當4-苯胺喹唑啉濃度為5和10μmol/L時，SGC7901細胞中E-cadherin的 mRNA表達是對照組的 161.2%（P<0.05）和298.1%（P<0.05），β-catenin的 mRNA 表達是對照組的 63.9%（P<0.05）和 19.6%（P<0.05）（表 1）。

表1 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞中E-cadherin和β-catenin mRNA表達的影響Tab 1 Effectof 4-anilinoquirazolineon E-cadherin andβ-catenin mRNA expression in SGC7901 cells

2.4 4-苯胺喹唑啉對SGC7901細胞Snail啟動子活性的抑制 如圖3所示，4-苯胺喹唑啉可降低SGC7901細胞Snail啟動子活性，且呈現劑量依賴性。4-苯胺喹唑啉濃度為5和10μmol/L時，Snail啟動子活性是對照組的62.3%（P<0.05）和18.3%（P<0.05）。

3 討論

EMT是胚胎發育過程中所必需的生理機制，隨著EMT的研究不斷深入，其在腫瘤轉移中的作用不斷被發現，成為EMT研究的熱點。腫瘤細胞在EMT過程中發生結構改變，E-cadherin逐漸喪失，波形蛋白、纖連接蛋白表達增加，導致腫瘤細胞極性喪失，與周圍組織、細胞接觸減少，遷移能力增強。研究發現，Src酪氨酸激酶在胃癌在內的多種惡性腫瘤中均發生異常活化，引起腫瘤細胞生長、增殖和黏附的異常，導致腫瘤轉移侵襲能力增強[2-3]。本研究證明，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉可抑制在SGC7901細胞中Src酪氨酸激酶磷酸化并呈劑量依賴關系，我們以此考察4-苯胺喹唑啉抑制人胃癌細胞EMT的作用及機制。

E-cadherin是重要的粘附分子，也是EMT的重要標志物，對維持上皮表型、穩定細胞間接觸有重要意義。E-cadherin蛋白隨著腫瘤惡性程度上升而下降，在正常組織中呈強表達，在腫瘤組織中呈低表達，甚至不表達。E-cadherin水平的下降可以導致腫瘤細胞黏附力降低，導致腫瘤細胞侵襲性增加[4]。本研究發現4-苯胺喹唑啉抑制Src酪氨酸激酶活性后，可顯著地增加胃癌細胞中E-cadherin的mRNA與蛋白表達，表明4-苯胺喹唑啉抑制EMT過程可能與其增加腫瘤細胞中E-cadherin表達有關。

β-catenin作為細胞黏附分子和信號傳導分子在維持細胞的結構和功能方面發揮重要的作用，可作為細胞骨架成份參與細胞黏附，并在細胞核內參與基因轉錄。β-catenin是經典的E-cadherincatenin復合體的重要成員，可與E-cadherin結合參與細胞黏附，參與細胞間的連接。β-catenin也是Wnt信號通路中調控轉錄活性的關鍵蛋白，可進入細胞核與核內轉錄因子TCF/LEF形成復合體，進而激活 c-myc、cyclinD1、MMPs等一系列 Wnt信號靶基因的轉錄，其異常表達對腫瘤的增殖和侵襲轉移有重要作用，促進上皮-間充質轉變[5]。本研究中4-苯胺喹唑啉可顯著地抑制胃癌細胞中β-catenin的mRNA與蛋白表達，表明4-苯胺喹唑啉對EMT的抑制作用可能與其抑制腫瘤細胞β-catenin表達有關，其機制可能與穩定的E-cadherin-catenin復合體，抑制 c-myc、cyclinD1、MMPs等促癌基因活化，從而抑制上皮-間充質轉變相關基因的表達。

近年來，許多研究證實Snail等多種轉錄因子在腫瘤轉移中起重要作用，可通過抑制E-cadherin的表達來促進EMT的發生。Snail屬于鋅指蛋白，可通過與Smad相互作用競爭性結合E-cadherin啟動子區的E-box序列，抑制E-cadherin表達，上調βcatenin表達，誘導EMT的發生[6]。Snail啟動子活性的降低可下調Snail表達，進而降低對E-cadherin表達的抑制作用。本研究中4-苯胺喹唑啉可顯著地抑制胃癌細胞中Snail轉錄活性，表明4-苯胺喹唑啉對EMT的抑制作用可能與其抑制腫瘤細胞Snail啟動子活性有關。

綜上所述，Src酪氨酸激酶的活性與胃癌EMT密切相關，其機制可能為Src酪氨酸激酶可調節Snail轉錄活性，進而調節E-cadherin及β-catenin表達有關。本研究表明，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉可顯著抑制EMT的發生發展，為臨床胃癌治療提供了理論依據。

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