胃腺癌cagA+幽門螺桿菌感染中HIF-1α和iNOS的表達及意義

張志廣，李 熳，聞淑軍，江 勇，翟浩宇，季英蘭

（天津醫科大學第二醫院消化科，天津300211）

胃癌目前是影響人類生存的惡性腫瘤之一，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)的感染已被公認是胃癌的重要致病因子。但Hp感染后只有極少數發生胃癌，說明胃癌的發生除了Hp感染以外，還與Hp的菌株毒力因素、宿主本身的遺傳學因素及環境因素有關[1]。目前已熟知的Hp毒素是細胞毒素相關蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）和空泡細胞毒素（vaculating cytotoxin A,VacA）兩種，編碼它們的基因分別稱為cagA和vacA，據文獻報道cagA+Hp感染更易加重胃炎的炎癥程度和萎縮程度，并與胃癌的發生密切相關[2]。缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是調節腫瘤細胞缺氧反應的主要轉錄因子，HIF-1α是其活性的亞單位，它可以通過上調其下游的基因來進一步參與腫瘤的侵襲和轉移。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS)就是其下游基因之一，其活性與許多腫瘤的血管生成密切相關[3]。目前有文獻報道Hp感染，特別是cagA+Hp感染可通過活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)來穩定HIF-1α的表達[4-5]。本文就cagA+Hp感染與胃癌的臨床病理關系及HIF-1α、iNOS的表達做一研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫科大學第二醫院1998-2004年間手術切除的胃腺癌標本，臨床資料和隨訪資料完整者198例，其中男137例，女61例，年齡26~86（65.28±11.24）歲。隨訪時間截止于2010年5月，術后生存時間為1~128月，平均生存時間為（38.25±25.06）月。其中c14呼氣試驗證實138例患者為Hp陽性，其中男93例，女45例，年齡32~86（66.04±10.02）歲，根據美國癌癥協會1997年第5版國際癌癥病期 （Tumor NodeMetastasis，TNM）分期標準：Ⅰ期17例，Ⅱ期34例，Ⅲ期56例，Ⅳ期31例。組織學分級：腸型胃癌87例，彌漫型胃癌51例。以上結果均經2名有經驗的病理醫師重新閱片驗證。

1.2 主要試劑 HIF-1α（1∶100稀釋，小鼠抗人，Labvision Neomarkers），iNOS（1∶100 稀釋，兔抗人，Santa Cruz）。PCR試劑盒購自大連寶生物有限公司。

1.3 常規免疫組織化學染色步驟 石蠟切片常規脫蠟至水后，微波熱修復，修復完畢后加入第一抗體，4℃過夜。免疫組織化學染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，顯示系統為PV-6001/6002（北京中杉），DAB顯色，蘇木素復染。各指標均設立相應陰性及陽性對照。

1.4 聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction,PCR）

取石蠟塊切片3片（厚12μm），經二甲苯脫蠟后，消化液（500mg/L蛋白酶K，10mmol Tris-HCIpH 8.0，10 mmol NaC1，1 mmol EDTA，100 g/L SDS）消化，酚-氯仿抽提DNA，-20℃備用。cagA引物序列：引物 1，5′-AATACACCAACGCCTCCAAG-3′，引物 2 5′-TTGTTGCCGCTTGCTCTC-3′，由大連寶生物有限公司合成。cagA PCR反應體系為50μL，包括DNA模板2μL，cagA引物1和引物2各0.75μL，Taq DNA 酶 0.5μL，10×Taq緩沖液 5μL，PCR 染液 5 μL，dNTP 1μL，ddH2O 34.5μL。cagA PCR 反應條件：95℃預變性4min后，95℃變性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環，循環結束后72℃延伸7min。反應結束后取13μL擴增水相用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，cagA在382 bp出現電泳帶為陽性。

1.5 免疫組織化學染色結果判定 HIF-1α及iNOS均以腫瘤細胞胞質呈棕黃色為陽性表達，HIF-1α也可見細胞核著色。隨機選擇10個有代表性的高倍鏡視野,每個視野記數100個腫瘤細胞，染色指數等于染色強度（基本不著色、淺黃、深黃和棕色分別為0、1、2、3分）與陽性細胞百分率（陽性細胞百分率 <5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分）計分的乘積。

1.6 統計學分析 應用SPSS16.0統計軟件包，計量資料以來表示。應用χ2檢驗進行率的比較，組間計量資料比較應用t檢驗及Mann-Whitney檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存曲線的差別，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 cagA基因型與胃腺癌臨床病理資料之間的關系 通過判定在382 bp出現的凝膠電泳的顯影條帶（圖1），138例胃癌中95例為cagA+，43例為cagA-。

將138例胃癌患者按性別、年齡（≥60歲和＜60歲）、腫瘤位置、大小、浸潤深度、組織學分型、血行轉移、淋巴結轉移和TNM分期進行分組，發現cagA基因與胃癌的浸潤深度密切相關，P=0.023（表1）。

表1 cagA與胃腺癌臨床病理資料的關系Tab 1 The relation of clinicopathologic data between cagA and gastric adenocarcinom a

2.2 cagA+Hp組和cagA-Hp組之間HIF-1α和iNOS的差異表達 HIF-1α和iNOS陽性表達可見于腫瘤細胞胞質或細胞核（圖2）。其在cagA+Hp組的表達均高于cagA-Hp組，P均<0.05（表2）。

2.3 cagA基因型與胃腺癌患者預后之間的關系 cagA+Hp感染組患者的平均生存時間為47.23個月，中位生存時間為34.55個月；cagA-Hp感染組患者的平均生存時間60.47個月，中位生存時間為42.73個月。cagA+Hp組和cagA-Hp組5年生存率分別是28.42%和32.56%。Log-rank值為3.166，P=0.075（圖 3）。

表2 cagA+Hp組和cagA-Hp組之間HIF-1α和iNOS的差異表達Tab 2 The differentialexpression of HIF-1αand iNOSbetween the groupsof cagA+Hp and cagA-Hp

3 討論

Hp在發達國家感染率達30%～50%，在發展中國家則高達80%～90%[6]。研究證實，Hp感染與胃炎、消化性潰瘍、MALT淋巴瘤及胃腺癌密切相關。但近20%~30%的感染者可終身攜帶Hp而不發??；50%以上的感染者僅有不同程度的慢性炎癥；10%~15%可發生消化性潰瘍；只有極少數發生胃部惡性腫瘤。說明胃癌的發生不僅僅與Hp感染有關，還與細菌的毒力因素，宿主的免疫反應和基因多態性及環境因素有關。

目前研究較多的是cagA基因，它只存在于50%~60%的Hp菌株中，編碼細胞毒素相關蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）。幽門螺桿菌以IV型分泌系統將CagA直接注入宿主細胞，CagA進入細胞后被細胞內特定的激酶磷酸化，從而引起細胞骨架的重排以及細胞內信號傳導系統的變化，最終導致炎癥、免疫反應，甚至細胞增殖、分化和凋亡平衡的改變，從而引起惡性病變的可能[7]。據文獻報道，cagA+Hp感染與胃炎的炎癥程度和萎縮程度及癌變均密切相關，其致癌機制可能是：cagA+基因株產生多種毒素可導致胃黏膜細胞癌基因過度表達，產生內源性突變物質，導致基因突變而發生胃癌；可使胃黏膜表皮生長因子濃度增高，氧自由基、超氧化物生成增加，引起細胞損傷及DNA斷裂誘發癌變；增加IL-8的分泌和一氧化氮合成，促進胃黏膜損害，加速胃組織細胞凋亡與癌變[8-9]。

目前大部分研究關注于Hp感染與胃癌的預后，但報道結果并不一致[10-12]。來自于德國和意大利的2篇報道均顯示胃癌中Hp陽性感染者的預后要好于Hp陰性感染者，1篇來自中國的研究報告卻發現2者之間并無明顯差異，他們應用RT-PCR方法檢測了Hp的mRNA拷貝數，發現伴有高拷貝數的胃癌患者預后要稍好于低拷貝數者,但無統計學意義。究其原因可能是因為Hp的感染激發了患者對腫瘤細胞的免疫反應，細菌本身的組分可誘導自身抗體出現，與腫瘤細胞產生交叉的免疫反應所致。但這些結論仍然有爭議，因為世界各地對于Hp感染的判定標準并非一致。

本研究第一次應用PCR的方法檢測Hp的cagA基因型，并比較它與胃腺癌的臨床病理特征的關系及預后的意義。筆者發現cagA+Hp感染的胃腺癌大多呈深度浸潤，但與腫瘤大小、位置、Lauren分型、淋巴結和血道轉移及TNM分期無明顯關系。另外筆者還比較了cagA+Hp組和cagA-Hp組間的HIF-1α和iNOS基因的表達，發現在cagA+Hp組中，二者均呈高表達，這可能是cagA+Hp感染的胃腺癌浸潤能力強的原因之一。因為HIF-1α作為一個重要的轉錄因子，可上調下游的靶基因，如VEGF、EPO、iNOS等的轉錄，參與了腫瘤的浸潤和轉移。iNOS可使胃黏膜內一氧化氮（NO）產生增多，在常氧條件下，NO可以通過防止HIF-1α降解來穩定它的表達，進而形成良性循環[13]。已有研究顯示HIF-1α與胃癌的發生密切相關，而Hp感染是胃癌重要的始動因素，Park等[4]研究發現胃上皮細胞的中性粒細胞對Hp感染產生的炎癥反應致使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生，最終導致細胞損傷和進一步DNA損傷，胃上皮細胞產生的ROS能在常氧狀態下導致HIF-1α的穩定表達。Suzuki和August等[14-15]進一步發現cagA+Hp感染可促發中性粒細胞更多的積聚，從而產生更多的ROS。Handa等[5]將cagA基因轉染至胃上皮細胞后，發現CagA蛋白可定位于線粒體中并產生大量的ROS。綜上可見cagA+Hp的感染可促進胃上皮細胞產生更多的ROS，從而參與其致炎致癌的過程，這其中也涉及到HIF-1α的通路，他們共同參與了cagA+Hp的致癌機制。

本研究初步探討了cagA+Hp感染與胃腺癌的預后意義，發現cagA+Hp感染者的預后要差于cagA-Hp患者，這可能與其促進ROS的產生，并進一步穩定HIF-1α的表達，上調其下游基因，如iNOS，來共同參與腫瘤的發生發展過程。筆者的病例數還較少，今后仍需進行大規模的流行病調查來驗證結論。

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