用釀酒酵母測定直接耐曬寶石藍的急性毒性

譚之楊，張尚勇

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用釀酒酵母測定直接耐曬寶石藍的急性毒性

譚之楊，張尚勇*

（武漢紡織大學 紡織科學與工程學院，湖北 武漢 430073）

本文的目的是建立直接耐曬寶石藍的急性毒性微量快速分析方法。通過用基于電阻法細胞計數原理的手持式細胞計數器測定由密度約為1.0×104細胞/ml的釀酒酵母懸液20 μl和系列濃度待測染料溶液130 μl與2.2倍YPD液體培養基110 μl所組成的體系在30℃、150 r/min恒溫搖床上震蕩培養6 h后的細胞數目，求算出該染料的EC50。結果顯示直接耐曬寶石藍對釀酒酵母的EC50為4995 mg/l，與文獻報道的小鼠經口LC50=5 g/kg一致。表明本法可作為傳統急性毒性測定的替代方法。

釀酒酵母；直接耐曬寶石藍；急性毒性

直接染料對纖維有較強的親和力，無須媒染劑就可以上染纖維素纖維，直接染料生產過程簡單，使用方便，價格低廉，廣泛應用于棉纖維染色，也可用于粘膠、真絲等纖維的染色以及制革、造紙等工業產品的染色。

多數直接染料的原料為芳香胺，芳香胺是一類致癌物質。因此，在德國首批禁用染料中，直接染料占了很大的比重，其中以聯苯胺、二甲基聯苯胺等三類衍生物作為中間體合成的直接染料占全部被禁用的直接染料的90%以上。

目前的直接染料檢測方法中規定使用的主要儀器是氣質聯用儀，目前全部依靠進口，每臺氣質聯用儀折合人民幣在80萬元左右，每臺設備一天最多只能檢驗30份樣品，同時在檢測處理過程中要使用大量高純度試劑和進口提取柱等材料，費用相當高。多數地市級檢測機構都沒有能力購置配備這一檢測設備，也就無法開展相應的檢驗工作，這制約了我國直接染料檢測的覆蓋范圍。

而傳統的急性毒性測試一般需要設置5-7個劑量組，同時規定每個劑量組的小鼠、裸鼠或豚鼠的數目不少于10只；大鼠、新西蘭兔的數目為6-8只；家兔、犬等的數目為4-6只，根據24 h的死亡率和14天內的總死亡數計算速死性化合物求其LD50(LC50)，并需要詳細觀察動物中毒癥狀的發生和發展過程，死前癥狀、死亡時間、體重變化、出汗流涎，血性分泌物、瞳孔改變、器官有無充血、出血、水腫或其它改變。

傳統急性毒性測定過程的復雜性、高成本、高耗時以及殘留的動物尸體對環境的二次污染等問題迫使人們嘗試開發魚類毒性測試、蚤類毒性測試、四膜蟲毒性測試、藻類毒性測試、發光細菌毒性測試和生物傳感器測試方法：

魚類毒性測試方法：魚類毒性實驗采用24 h、48 h、96 h測定有毒物質的LC50，適用于水中單一物質的毒性測定，但靜水法、換水法和流水法測定結果不一致，同時需要大量實驗材料和多次重復實驗[1]。

蚤類毒性測試方法：蚤類是國際上普遍采用的實驗生物[2，3]。采用死亡率、捕食行為改變為指標。但標準不易統一。

四膜蟲毒性測試方法：采用單細胞凝膠電泳技術(SCGE)和流式細胞術聯合檢測四膜蟲()的彗尾長度、拖尾率、細胞損傷率、DNA損傷以及DNA相對熒光強度，從DNA損傷角度探討工業廢水中常見的含氮雜環化合物對四膜蟲的毒性作用[4]。但該法所測試的毒性種類有限，很難用于染料及其印染廢水毒性測試。

藻類毒性測試方法：斜生柵藻、小球藻、鹽澤螺旋藻、扁藻等的生長抑制為測試指標可測定被檢測物的急性毒性，也有將細菌熒光酶基因轉入絲狀體固氮藍藻-魚腥藻中，利用其作為報告基因，通過對發光強度的測定來檢測被測物的急性毒性[5]。但是工作量大，測定周期長，而且不適用于染料。

發光細菌毒性測試方法：美國Backman公司研制了一種商品名為Microtox的生物發光光度計(即生物毒性測定儀)[6]，其中明亮發光桿菌發光強度的變化檢測污染物的毒性的靈敏度與魚類96 h急性毒性實驗相當。我國于1995年將這一方法列為水質急性毒性檢測的標準方法。青海孤菌(sp. nov.)也用于淡水樣品的生物毒性檢測。硝化細菌也用于有毒物質的毒性檢測。英國PPM公司研發了一種名為AMTOX的在線測試儀，該儀器基于固定化硝化細菌消耗樣品中的氨，并通過測定底物中氨氮的消耗速率來檢測樣品的毒性。但是，發光細菌法檢測毒性具有發光強度本底值差異較大，檢測期間發光變化幅度寬的問題，所測得的數據不準確。同時，由于許多染料本身是熒光淬滅劑，不適于該法。

生物傳感器測試方法：用于毒性檢測的生物傳感器有酶傳感器[7]、微生物傳感器[8]、DNA傳感器[9]和免疫傳感器[10]等。但是，酶、DNA和抗原-抗體的專一性強，因此，一種生物傳感器只能特異地檢測一種物質的毒性。

目前還沒有建立適用于評價染料及其印染廢水毒性的合適方法。因此，只有少數染料具有急性毒性LD50數據，絕大多數染料的毒性數據還是空白。開發可靠、方便、快捷的生物毒性檢測方法成為當務之急。本文進行了直接耐曬翠藍GB(又稱錫利翠藍GL、直接耐曬翠藍GL、直接耐曬寶石藍；Lionol Blue GB)的急性毒性測定。

1 材料與方法

1.1 制備釀酒酵母菌懸液

在超凈工作臺內，用無菌牙簽收集平板培養釀酒酵母單菌落轉入標號為①的已滅菌的Eppendorf管中，加入1000 μl無菌純水混懸，取該混懸液200 μl加入1支5 ml無菌試管中，加入1.8 ml無菌純凈水，在分光光度計上測得OD600=0.248，得知①號管中懸液的細胞密度為0.248÷1.4×108×10=1.7714×108個/ml；從①管取56.4 μl入②管，加入944 μl無菌純凈水即成1×107個/ml的菌懸液；將②管中的菌懸液稀釋1000倍，即配制成細胞密度約為1.0×104個/ml的菌懸液，放入4℃冰箱中備用。

1.2 配制直接耐曬翠藍GB溶液

用電子天平稱取60 mg直接耐曬翠藍GB入5 ml連蓋離心管中，加無菌純水3 ml溶解，放入4℃冰箱中備用(染料儲備液)；將編號為0#-11#和編號為0’#-11’#的1.5 ml無菌Eppendorf管，分兩排放在5×16=80孔多功能彩色離心管架上，用單道可調20-300 μl量程移液器配合20-300 μl吸頭分別取130 μl濃度為20000 mg/l的待測直接耐曬翠藍GB溶液入11#、11’#和10#管；在10#管中加入無菌純水260 μl，混勻后；從10#管分別取130 μl混合液入10’#和9#管，并加入無菌純水260 μl，然后混勻，依次配制8#-1#、9’#-1’#管溶液，從1#、1’#管用移液器取出130 μl混合液棄去；得到20000、6667、2222、741、247、82.3、27.4、9.14、3.05、1.02、0.34 mg/l共11種濃度的直接耐曬翠藍GB待測溶液共2組。

1.3 培養細胞

將上述24支Eppendorf管放在冰浴中，0#和0’#管則加入130 μl無菌純凈水，所有管中均加入2.2倍YPD液體培養基110 μl和20 μl細胞密度為3.0×105個/ml的菌懸液；蓋好管蓋，在30℃、150 r/min恒溫搖床上振蕩培養7.5小時。

1.4 洗滌細胞

取出各離心管放入小型高速離心機中，用4000 r/min離心10 min，棄上清液；用12道可調20-300 μl量程移液器加入PBS(pH 7.4)緩沖液300 μl洗滌各離心管中的細胞團2次。

1.5 計數懸液制備

將各洗滌后的細胞團分別用PBS(pH 7.4)緩沖液配制成240 μl菌懸液。

1.6 測定細胞數目

用電阻法細胞計數原理的手持式細胞計數器測定菌懸液的細胞濃度。

1.7 求算染料EC50范圍

將所測得的各管菌懸液的細胞濃度減去初始細胞濃度，除以對照管菌懸液的細胞濃度，定義為細胞分裂率；將相同濃度染料的細胞分裂率平均，將染料濃度除以2所得數值為橫坐標、平均細胞分裂率為縱坐標繪圖，得到一條曲線，通過縱坐標上的一點(0,50)作X軸的平行線，交曲線于A點，過A點作Y軸的平行線，交X軸于B點，B點的橫坐標數值即為所求染料的EC50范圍。

1.8 測定和求算染料EC50

重復步驟1.2至步驟1.7，但步驟1.2中的梯度稀釋系數需根據染料EC50范圍重新確定，分別將a取整，得到L’和H’，以L’和H’為再次測定過程中的染料溶液的濃度范圍。B1點的橫坐標數值即為所求染料的EC50-粗略值，將B1上下兩個濃度值分布記為L1和H1，將線段L1H1分成10等份，觀察B1對應的小刻度數值，并記為b；然后根據公式(H1- L1)÷10×b計算出EC50值。

2 結果與分析

2.1 不同濃度直接耐曬翠藍GB對釀酒酵母細胞增殖的影響（見表1）

表1 直接耐曬翠藍GB對釀酒酵母細胞增殖的影響

2.2 染料EC50范圍為3333~10000 mg/l（見圖1）

圖1 直接耐曬翠藍GB對釀酒酵母分裂的影響

圖2 EC50范圍直接耐曬翠藍GB對釀酒酵母分裂的影響

2.3 染料EC50值為4995 mg/l

即L1=4400，H1=5100，將線段L1H1分成10等份，可見B1對應的小刻度數值約為b=8.5，EC50=(H1-L1)÷10×b=(5100-4400)÷10×8.5=4995 mg/l，見圖2、圖3。

圖3 直接耐曬翠藍GB的EC50的求算示意圖(局部放大)

3 討論

計算出EC50=4995 mg/l。與文獻報道的小鼠口經LC50=5 g/kg一致。

和現有的方法相比，本方法具有如下主要優點：

微量：消耗的待測染料低于60 mg，特別適用于紡織品上染料的急性毒性測試。

快速：測定一種物質的大致EC50-范圍的時間不超過8 h，一人在一天內可測試上百種物質；測定一種物質的EC50由一人在一天內可完成。

低耗：測定1種樣品消耗：1只25 ml無菌試管，折合人民幣0.1元；54只20-300μl 標準吸頭，折合人民幣5.94元；55只1.5 ml連蓋離心管，折合人民幣2.2元；YEPD液體培養基5.5 ml，折合人民幣0.03元；PBS(pH 7.4)緩沖液42.3 ml，折合人民幣0.04元；Scepter傳感器24片，折合人民幣48元；電費4.00元；合計60.3元人民幣。如果同時測定幾種物質，則測定費用更低。

方便：只需要超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫搖床、離心機、電阻法手持式細胞計數器即可方便地開展工作，全部設備總價值最低可達4萬元人民幣以下。

通用：適用于各種在水中有一定溶解度的物質的急性毒性測試。

[1] 文琛, 鄔紅娟, 王宇飛. 孔雀石綠對三種魚類細胞急性毒性的初步研究[J]. 環境科學與技術, 2007,30(6):8-9,34.

[2] Magda C, Andreja D, Milenko R, et al. Daphnia magna wastewater toxicity assays: an interlaboratory study [J]. International Journal of Environment and Pollution 2007,31(1-2):13-21.

[3] GB/T13266-91 水質-物質對蚤類（大型蚤）急性毒性測定方法[S].

[4] 徐忠東, 施榮華, 耿明,等. 含氮雜環化合物對四膜蟲的毒性作用研究[J]. 中國農業大學學報, 2008,13(3):57-62.

[5] ISO20079 Water quality - Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed ()-Duckweed growth inhibition test [S].

[6] J. A. Aruldoss and T. Viraraghavan. Toxicity Testing of Refinery Wastewater Using Microtox [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1998, 60(3): 456-463.

[7] Zhylyak G A, Dzyadevich S V, Korpan Y I, et al. Application of urease conductometric biosensor for heavy metal ion determination [J]. Sensors and Actuators B,1995,24-25:145-148.

[8] Nakamura H, Karube I. Current research activity in biosensors [J]. Anal Bioanal Chem, 2003,377:446-468.

[9] Toombelli S, Mascini M, Sacco C, et al. A DNA piezoelectric biosensor assay coupled with a polymerase chain reaction for bacterial toxicity determination in environmental samples [J]. Analytica Chimica Acta,2000,418:1-9.

[10]湯琳,曾光明,黃國和,等.免疫傳感器用于環境中痕量有害物質檢測的研究進展[J].環境科學,2004,25(4):170-177.

Determination of the Acute Toxicity for Direct Fast Turquoise Blue GL by Saccharomyces Cerevisiae Meyen ex Hansen

TAN Zhi-yang, ZHANG Shang-yong

(College of Textile, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430073, China)

This study was aimed to establish a quick acute toxicity analysis for Direct Fast Turquoise Blue GL (DFTB). Yeast (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen) cell suspension which density was about 1.0×104cells/ml was preparation. Then a series of concentrations of the dye solution was preparation. The suspension systems were composed of 20 μl of the yeast suspension, 130 μl of the series of concentrations dye solution and 110 μl of 2.2-fold YPD liquid medium. Yeast cells were grown in the suspension system on a shaker with 150 rpm at 30°C. After incubated for 6 h, cell numbers were counted with a hand-held cell counter (Millipore Scepter). EC50was calculated. The results suggest that the EC50of DFTB was 4995 mg/l and the results were satisfactory. Conclusion: This method can be used as an alternative to the traditional LD50to acute toxicity determined in mice.

Saccharomyces Cerevisiae; Direct Fast Turquoise Blue GL; Acute Toxicity

X502

A

1009－5160(2012)03－0056－04

國家自然科學基金資助項目（50978208).

*通訊作者：張尚勇（1967-），男，博士，教授，研究方向：紡織科學與工程.