不同產地腫節風藥材多酚類成分及抗氧化活性比較

南華大學附屬第一醫院（4200）黃明菊 李卓

中南大學（410013）周應軍2

腫節風為金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai.的干燥全株，分布于我國長江流域以南各省。腫節風具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效，臨床上主要用于治療惡性腫瘤、感染性疾病、口腔疾病、跌打損傷等癥[1][2][3][4]。我們的前期研究已從腫節風藥材的水提取液中分離并鑒定了23個單體成分，同時對腫節風抗氧化活性進行了初步研究，試驗結果表明，腫節風多酚類部位具有很強的抗氧化活性，而且由此部位分離得到的多種化學成分也具有很強的抗氧化活性[5][6][7][8][9]。

為進一步分析研究腫節風的化學成分組成及抗氧化活性，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對腫節風多酚類部位進行了分析，通過與對照化合物比較（保留時間和紫外吸收圖譜），標定了HPLC圖譜上的14個主要的色譜峰，分析了7個不同省份腫節風藥材的HPLC色譜圖，試驗結果表明，各省份藥材的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類型：咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類，但圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產地腫節風藥材均有抗氧化活性，但不同產地活性大小差異較大。HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致。現將我們的研究分析報告如下，以便為相關技術人員對腫節風藥材的質量控制與開發利用提供一個參考依據。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵，在線脫氣機、自動進樣器、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站；BP210S型電子天平（德國Sartorius公司），Elx-800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 試劑與藥材 乙腈為色譜純（TEDIA company），水為市售純凈水，丙酮（湖南師大化學試劑廠）、磷酸（汕頭市光華化學廠）、碳酸氫鈉（天津市巴斯夫化工廠）均為分析純，聚酰胺（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。DPPH?（二苯代苦味酰基自由基）購于SIGMA公司；95%乙醇（分析純，購自天津博迪試劑公司）。對照化合物（經HPLC檢測純度均大于90%），均為從腫節風中分離所得，并通過化學與波譜手段鑒定其結構。腫節風藥材7批，均從各產地購買。

2 方法

2.1 腫節風多酚類部位儲備液的制備 精密稱取腫節風藥材10.0g，加水250mL煎煮1小時后，加水補足失重，過濾，取續濾液200mL，并將其減壓濃縮至小體積，加水補足至20mL，加入丙酮60mL，搖勻，放置過夜。取上清液60mL，濃縮干，加水5mL使其溶解，通過已處理好的聚酰胺柱（30～60目，水裝柱，25mL），水洗脫2BV，棄去水洗脫液，0.5%碳酸氫鈉溶液洗脫5BV，收集洗脫液，用鹽酸調pH=5～6，蒸干，殘渣加10mL水溶解，作為儲備液。

2.2 腫節風多分類部位指紋圖譜研究

2.2.1 供試品溶液的制備

2.2.1.1 對照品溶液 稱取各對照品化合物適量，用50%甲醇配成約為0.5mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液 取腫節風多酚類部位儲備液經45μm濾膜過濾，作為供試品溶液待用。

2.2.2 色譜條件的優化

2.2.2.1 流動相的確定 參考相關文獻[10]，確定流動相系統為乙腈-磷酸-水，采用梯度洗脫，A相為乙腈，B相為0.1%的磷酸水溶液，經比較多種梯度條件，最后確定梯度程序為：0～5min，5% A線性梯度至7.5% A；5～13min，線性梯度至10.0% A；13～25min，線性梯度至15% A；25～30min，線性梯度至17.5% A；30～40min，線性梯度保持17.5% A；40～45min，線性梯度至20%A；45～50min，線性梯度保持20% A；50～55min，線性梯度至80% A。在此條件下，各色譜峰分離度好，保留時間適中。

2.2.2.2 檢測波長和流速的確定 采用二極管陣列檢測器，得到在190～400nm各波長下的色譜圖，最后選定310nm作為檢測波長，并記錄190～400nm范圍內的紫外吸收圖。在310nm波長下，各共有色譜峰分離情況良好，且均有較大的吸收峰值。對0.5，0.7，1.0mL/min進行了考察，1.0mL/min條件下色譜峰的峰形與保留時間較好。

2.2.3 方法學考察

附圖 各產地腫節風的HPLC圖譜（A、B）

附圖A 腫節風藥材提取液（產地：湖南）

附圖B 對照品混合液

2.2.3.1 精密度試驗 取湖南藥材（批號：2006033008）制備供試品溶液，連續重復進樣5次，每次10μL，記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各

共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.2 穩定性試驗 取精密度試驗下供試品溶液分別在0、6、12、18、24、48小時進樣分析，并同時記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.3.3 重現性試驗 取同一批湖南藥材（批號：2006033008）樣品5份，制備供試品溶液，在上述色譜條件下分析，并同時記錄各共有主要峰的保留時間和峰面積，結果顯示，各共有主要峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%。

2.2.4 樣品測定 按確定的色譜條件和測定方法，分別對7個供試品進行檢測，并同時記錄各樣品的色譜圖和紫外吸收圖；在相同的色譜條件下，記錄各對照化合物混合樣品的色譜圖和紫外吸收圖。

附表1 各樣品HPLC色譜圖主要成份峰面積及總峰面積

附表2 不同產地腫節風藥材對DPPH自由基清除率及IC50

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 供試品溶液的制備

2.3.1.1 樣品溶液 取儲備液1mL，分別用95%乙醇稀釋至相應的濃度梯度（相當于藥材6，2，0.6，0.2，0.06mg/mL）的樣品5份。

2.3.1.2 DPPH溶液 稱取DPPH適量，用95%乙醇配成2×10-4mol/L的溶液。

2.3.2 DPPH?自由基清除率的測定 分別量取上述供試品溶液與DPPH?溶液各100μL于96孔板中，每個濃度設4個復孔，在搖床上震搖2min，避光反應28min后用酶聯免疫儀在517nm下用95%乙醇調零測定吸光值。重復試驗3次。

3 結果與討論

3.1 各產地腫節風藥材的HPLC圖譜分析。色譜峰的歸屬：1：3，4-二羥基苯甲酸；2：結構待定；3：綠原酸；4：咖啡酸-4-O-奎寧酸；5：咖啡酸；6：丁香酸；7：咖啡酸-4-O-奎寧酸甲酯；8：咖啡酸-3-O-奎寧酸甲酯；9：異秦皮啶；10：新落新婦苷；11：槲皮素-3-Oα-D-葡萄糖醛酸；12：迷迭香酸-4-Oβ-D-葡萄糖；13：山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸；14：迷迭香酸。

對比對照化合物色譜圖與各樣品HPLC圖譜上相應色譜峰中的保留時間和UV圖譜標定了的指紋圖譜上的14個特征色譜峰（見附圖A、B）。比較各產地藥材的HPLC圖譜，結果顯示，各樣品的HPLC圖譜顯示出，各產地腫節風藥材在整體上來說較為相似，主要的色譜峰組成基本一致，成分主要有3類，分別為咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類。

HPLC圖譜提示不同產地的藥材在化學成分上存在的差異：①峰面積總和差異：各樣品HPLC圖譜的總峰面積大小差異顯著，其中，鋒面積最大的廣西藥材是鋒面積最小的貴州藥材的4.15倍（見附表1）。②特征峰差異：廣東產藥材新落新婦苷（峰10）的色譜峰較明顯，而其他產地藥材的HPLC圖譜中，新落新婦苷的色譜峰很微弱或者根本檢測不到。廣西產腫節風藥材中迷迭香酸（峰14）的峰面積明顯較其他產地的藥材高，是其他產地藥材的3.0～11.3倍。

3.2 腫節風多酚類部位的抗氧化活性 不同濃度的腫節風藥材提取液清除DPPH自由基的能力見附表2。由附表2可以看出，腫節風藥材具有很強的清除DPPH自由基的能力，在0.03～3mg/mL的濃度范圍內，隨著提取物濃度的增加，腫節風藥材對DPPH自由基的清除能力逐漸增強。

由附表2可知，各產地腫節風藥材均顯示了較好的抗氧化活性，但不同產地的藥材抗氧化活性存在有較大的差異。由于各產地的藥材處理方法一致，而且各藥材多酚類成分的組成基本相同，因此，各樣品的總峰面積可以粗略反映出其中多酚類含量的相對高低，結合附表1可發現，各產地腫節風總多酚類化合物總峰面積的大小與其抗氧化活性強弱基本一致，總峰面積較大的樣品抗氧化活性也較強。

本次研究表明，7個不同省份腫節風藥材多酚類化合物的成分組成基本相同，成份組成主要有3種類型：咖啡酸衍生物、黃酮類和香豆素類，但色譜圖譜上各主要色譜峰的峰面積差異較大。不同產地腫節風藥材均有抗氧活性，HPLC圖譜總峰面積與抗氧化活性大小基本一致，但不同產地活性大小差異較大，產生的這一差異可能是由于各產地藥材天然生長環境、加工及儲存等環節的不確定性，導致各產地藥材的化學成分和生物活性差異較大。因此，為避免上述可能的影響因素，建議對腫節風進行人工栽培種植，并固定加工儲存條件以穩定原藥材的質量；企業在采購原藥材時應根據需要選擇合適產地的原料，固定產地，并對其指紋圖譜加以考察控制，以保證產品質量的均一性和穩定性。

綜上所述，各企業在選擇藥材時，一定要針對企業本身具體的需要、各藥材本身的品質及有效成分的活性、各不同產地藥材的色譜圖比較情況等要素，謹慎地選擇適合自己企業需要的產地的藥材。