青島地區兔肺炎克雷伯氏菌分離鑒定

王召朋 柴同杰 牟特 呂長輝

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青島地區兔肺炎克雷伯氏菌分離鑒定

王召朋①柴同杰②*牟特①呂長輝②

（①青島康大外貿集團公司 膠南 266400 ②山東農業大學動物科技學院）

對青島地區某兔場病死兔的病變器官組織進行細菌分離和純培養，對所分離的細菌進行形態特征、理化性質和16SrRNA序列的分子鑒定和測序，人工感染以及藥敏試驗，判定為肺炎克雷伯氏菌。代表菌株16SrRNA序列長度1414bp，與GeneBank登錄號為EU360123.1的肺炎克雷伯氏菌16SrRNA序列同源性100%，人工感染小鼠24h全部死亡，對供試的諾氟沙星等藥物高度敏感，對供試的強力霉素等中毒敏感，對頭孢拉定等耐藥。應用篩選的敏感藥物，并采取綜合防治措施，使疫情得到了有效控制。

肉兔 肺炎克雷伯氏菌 分離 藥敏試驗

肺炎克雷伯氏菌屬腸桿菌科克雷伯氏屬，是一種常見的條件性致病菌，廣泛分布于動物的消化道以及水、土壤和谷物中，可引起人畜發生肺炎、腹膜炎、子宮炎以及腹瀉，甚至發生敗血癥。近年來現代養殖業生產方式得到迅猛發展，但由于養殖戶的管理水平、養殖場的硬軟件設施跟不上規模擴大的需要等原因，已經有多起有該菌引起的家畜感染的報道。

青島某兔場在入冬后，部分母兔及仔兔發生腹瀉病死亡，臨床癥狀主要表現為腹脹，輕度腹瀉，糞便呈深褐色水樣，病例解剖發現盲腸、小腸漿膜充血出血，充滿氣體，腸內為深褐色或紅褐色水樣內容物，使用慶大霉素、安普霉素等抗生素治療無效，且發病率和死亡率升高。為有效控制該病，對病死兔進行了剖檢采樣和病原分離鑒定，并進行了動物實驗和藥敏試驗，篩選出有效藥物，及時進行防治。

1 材料和方法

1.1 試劑 DHL瓊脂、營養瓊脂、脫纖維羊血、麥康凱瓊脂、普通肉湯和生化鑒定管購自北京陸橋技術有限責任公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR預混料購自天根生化科技有限公司；Marker2000購自Taraka公司；DNA回收試劑盒購自OMEGA公司。

1.2 病原分離培養 取病死兔病變組織，無菌操作劃線接種DHL瓊脂平皿、血瓊脂平皿、營養瓊脂平皿和麥康凱瓊脂平皿，至37℃溫箱培養18~24h，觀察結果。

1.3 染色及顯微觀察 將分離培養出的可以菌進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態。

1.4 生化試驗 可疑菌普通肉湯純培養物進行三糖鐵、V-P、硝酸鹽還原、M.R、西蒙氏檸檬酸鹽、丙二酸鹽、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、乳糖、靛基質、半固體動力生化試驗。

1.5 動物試驗 試驗用小白鼠8只，分試驗組和對照組，每組4只。將可疑菌普通肉湯培養物試驗組每只腹腔注射0.1ml，對照組每只腹腔注射生理鹽水作為對照，飼養觀察。對發病及死亡小鼠進行解剖和病原菌分離培養。

1.6 分子生物學鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取的DNA作為模板，引物采用16SrRNA通用引物，上、下游引物序列分別為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生物工程公司和成。PCR反應體系25μl：1.0ml的模版DNA，10×PCR buffer (Mg2+free)2.5ml，MgCl2(2.5mmol/L)2ml，dNTP(2.5mmol/L)1.3ml，上下游引物(25μmol/L)各1ml，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl；最后用滅菌雙蒸水補足到25ml。PCR基本反應程序為94℃5min、94℃1min、55℃ 1min、72℃70s，共進行32個循環，最后于72℃延伸7min。PCR產物經10g/L瓊脂糖電泳后，按OGEMA凝膠回收試劑盒回收目的片段，送上海生物工程公司測序。

1.7 藥敏試驗 取普通肉湯24h純培養物1ml均勻涂布于營養瓊脂平皿上，貼上藥敏紙片，置于37℃溫箱培養24h后觀察試驗結果。

2 結果

2.1 病原分離培養結果 在不同培養基上均長出了較大的粘液狀菌落，相鄰菌落易融合成濃汁樣，接種針挑取時可拉出絲。在DHL瓊脂平皿上菌落淡粉色、大而隆起、光滑濕潤；在麥康凱瓊脂平皿上菌落呈紅色；在營養瓊脂平皿上菌落乳白色、大而隆起，光滑濕潤；在血瓊脂平皿上不溶血。

2.2 染色鏡檢結果 革蘭氏染色陰性，短桿菌，單個或成雙排列，有莢膜，無芽孢。

2.3 生化試驗結果 三糖鐵37℃溫箱培養24h，斜面產酸，底層產酸產氣，硫化氫陰性。其他理化性質見表1。

表1 生化試驗結果

2.4 動物試驗結果 普通肉湯培養物接種小鼠后，試驗組4只小鼠24h內全部死亡，對照組小鼠全部健活。死亡小鼠肺臟、肝臟細菌分離培養后染色鏡檢，得到與接種細菌相同的菌株。

2.5 分子鑒定結果 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)。

圖1 PCR鑒定結果

(M: DL5000，0:陰性對照，1-3：待測菌株)

測序后經BLAST分析測序結果表明：該菌株16SrRNA與肺炎克雷伯氏菌(GeneBank中的序列注冊號EU360123.1)的同源性最高，達100%。

2.6 藥敏試驗結果 藥敏結果判定依據為《抗菌藥物藥敏紙片判斷標準》。此次分離出的肺炎克雷伯氏菌對諾氟沙星等藥物高度敏感，對強力霉素等中度敏感，對頭孢拉定等耐藥，具體結果見表2。

表2 藥敏試驗結果 (mm)

3 討論

從本次發病臨床癥狀、病理變化、鏡檢觀察和生化特性分析，與肺炎克雷伯菌高度相似，通過分子生物學鑒定，結果表明病原菌與肺炎克雷伯氏菌同源性達到100%，從而證明了該菌即為肺炎克雷伯氏菌。通過染色鏡檢、生化鑒定等常規檢測方式與分子生物學鑒定的對比，分子生物學鑒定準確性最高，操作簡便快捷。

肺炎克雷伯氏菌作為家兔體內常在菌群，易引起家兔呼吸和消化系統疾病，且多為散發性病例，而像本次較大規模發病，引起斷奶前仔兔大量腹瀉死亡的病例報道較少。此次除肺炎克雷伯氏菌外，還分離到了致病性大腸桿菌，發病初期臨場癥狀與大腸桿菌病較接近，但用藥后病情沒有改善，發病率和死亡率升高，臨床癥狀也發生變化，加大用藥量也無明顯改善。說明此次肺炎克雷伯氏菌發病是由于氣候變化、仔兔體質較弱及其他疾病等因素引起的，同時因該菌具有較強的耐藥性，用藥后仔兔腸道內菌群失調，也是爆本發病的一個主要原因。

肺炎克雷伯氏菌可以產生各種使抗生素失活的酶，這是造成該菌具有耐藥性的原因，而且臨床分離的菌株大多為多重耐藥性菌株，給生產中防治該病造成了很大的困難，同時對養殖人員的健康也構成了一定的威脅。因其耐藥的特性，預防成為了防治該病的主要手段，增強家兔免疫力，減小或避免各種應激，減少抗生素的濫用，都有利于預防該病的發生。一旦發生本病，早期診斷和有效藥物的及時使用，是治療本病的主要方法。針對此次肺炎克雷伯氏菌病，除使用有效抗生素外，還配合使用了腸道微生態制劑，提高體質和免疫力，使病情很快得到了控制。

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（2012–03–08）

通訊作者

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1007-1733(2012)05-0016-03