圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀及其在花青素分離中的應用

裴海閏，曹學麗*

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀及其在花青素分離中的應用

裴海閏，曹學麗*

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

所研制的圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀采用雙分離柱串聯設計，公轉半徑為70mm，β值范圍為0.3～0.7，柱總容積為30mL。將所研制的新型分離柱與傳統多層纏繞色譜柱對不同溶劑體系的保留能力進行對比，根據溶劑極性不同，分別選擇正庚烷-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正丁醇-醋酸-水及聚乙二醇1000-磷酸鉀鹽-水雙水相體系用于固定相保留能力的研究。結果表明：在L-I-T洗脫模式下，當流速為1mL/min時，傳統多層纏繞色譜柱和圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀在正庚烷-甲醇體系中的固定相保留率(Sf)分別為50%和60%，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的Sf值分別為60%和68%。在U-O-H洗脫模式下，流速為0.5mL/min時，傳統多層纏繞色譜柱和圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀在正丁醇-醋酸-水體系中的Sf值分別為22%和60%；在L-I-T洗脫模式下，流速為0.5mL/min時兩種色譜柱在聚乙二醇1000-磷酸鉀鹽-水雙水相體系中的Sf值分別為15%和46%。各個體系下Sf與(1/g-levels)1/2線性相關。將所研制的新型逆流色譜儀初步應用于黑果枸杞花青素樣品的分離，對其實際分離純化能力進行考察研究。采用極性較強的甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(體積比2.5:1.5:1:5:0.001)，在1mL/min的流速下，分離得到純度89%黑果枸杞花青素。

高速逆流色譜；圓盤嵌入式螺旋管柱；雙水相全系；花青素

高速逆流色譜(h ig h-s pee d cou ntercurre nt chromatography，HSCCC)[1]以液-液萃取和離心分配為基礎，利用螺旋形柱體在做高速行星式運動時產生的離心力，使互不相溶的兩相溶劑不斷混合，隨流動相引入螺旋形柱體的樣品在兩相之間反復分配，按分配系數的次序，依次被流動相洗脫出來。目前常用的高速逆流色譜儀都采用J型多層纏繞的聚四氟乙烯螺旋管分離柱設計[2]。溶劑系統的物性參數對固定相保留率有很大的影響，如兩相密度差、黏度、界面張力等。Berthod等[3]研究表明，兩相的密度差對固定相保留率的影響最大，固定相保留率和密度差基本呈線性關系。流量、轉速對固定相保留率影響的研究較多。Du Qizhen等[4]總結出了固定相保留率和流量平方根之間的線性關系。Sutherland等[5-6]發現了流動相線性速率的平方和體積流量之間的線性關系。

由于高速逆流色譜儀是利用螺旋管色譜柱在行星式運動過程中產生的阿基米德螺旋力實現固定相的保留，因此可以通過擴大螺旋管的盤繞螺距來提高固定相的保留率[7]。在傳統的螺旋管柱逆流色譜儀中，螺距受到螺旋管外徑的限制，由里到外離心力的增長速率緩慢，因而對一些極性強、黏度高的溶劑體系保留能力較弱。近年來，一種在圓盤刻蝕螺旋槽方式的被應用于高速逆流色譜分離柱的設計，可使螺旋槽的螺距明顯增加[8-11]。

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)是茄科枸杞屬的多年生耐鹽、抗旱植物，分布于我國西北地區，其果實中含有豐富的花青素，是天然花色苷類色素的資源。當前花色苷由于其無毒又兼具營養藥理作用，在食品醫藥等領域受到重視[12-14]。目前對黑果枸杞色素的研究還僅限于其粗提取物，對其中花青素的純品的研究還很少。樣品來自中國科學院西北高原生物研究所提供的黑果枸杞色素提取物，將嘗試采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(三氟乙酸)體系對該色素提取物中的花青素進行分離純化。由于該體系在傳統多層纏繞HSCCC上的保留率很低(＜20%)，達不到分離的要求，因此考慮在圓盤嵌入式螺旋管HSCCC上進行實驗，以期得到較高的保留率，并將其分離。

在已有研究的基礎上設計并研制了一種圓盤嵌入式螺旋管柱高速逆流色譜儀樣機。通過在一個圓柱形圓盤上設置螺旋槽，并在其中嵌入多層螺旋管的方式設計了一種新型的逆流色譜分離柱；通過一系列實驗就其與傳統高速逆流色譜儀的保留能力進行比較。同時選取基礎體系為甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(1:2.5:1.5:5:0.001)，首先考察該體系在圓盤嵌入式螺旋管HSCCC上的最佳洗脫模式，從中選取最佳的洗脫模式進行分離實驗，樣品經高效液相色譜檢(HPLC)以及高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)檢測純度和推測結構。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞色素提取物，由中國科學院西北高原生物研究所提供。

正庚烷、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、冰醋酸(均為分析純) 國藥集團化學試劑北京有限公司；甲基叔丁基醚、乙腈、三氟乙酸(均為色譜純) 美國Fisher公司；蒸餾水自制。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 1100 離子阱質譜儀 美國Agilent公司；圓盤嵌入式螺旋管色譜儀的分離柱 本實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 溶劑體系及樣品的配制

采用的溶劑體系有正庚烷-甲醇體系(體積比1:1)、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系(體積比1:1:1:1)、正丁醇-醋酸-水體系(體積比4:1:5)、聚乙二醇(PEG)1000-磷酸鉀鹽-水(pH9.0，質量比12.5:12.5:75)4種體系。根據溶劑體系的組成，在分液漏斗中配制并充分混合，室溫靜置平衡分層，使用前分離。

樣品混合溶液的配制：稱取一定量的不同種類的樣品溶解于一定體積的上相或下相流動相中，制得混合樣品。

1.3.2 高速逆流色譜洗脫模式

在使用高速逆流色譜進行分離時所用的洗脫模式可用3個參數聯合進行描述，即流動相的選擇-流動相在螺旋槽中的流動方向-色譜柱轉向。對于每一種溶劑體系均可有8(23)種不同的分離洗脫模式可供選擇。在流動相選擇時，對于同一溶劑體系，可選擇上相(U)或者下相(L)作為流動相。圓盤嵌入式螺旋管色譜柱其進口端和出口端可以是螺旋槽的內端(I)，也可以是螺旋槽的外端(O)。對一個兩端封閉的分離柱而言，無論轉動方向如何，管路中互不相溶的兩相溶劑都趨于向同一端流動，該端定義為為首端(H)，另一端為尾端(T)。采用的洗脫模式如下：

1)L-I-H：柱體順時針旋轉，以下相為流動相，從螺旋槽的I即此旋轉方向時的H，向流通槽的O即T流動。2)U-O-H：柱體逆時針旋轉，以上相為流動相，從螺旋槽的O即此旋轉方向時的H，向流通槽的I即T流動。3)L-I-T：柱體逆時針旋轉，以下相為流動相，從螺旋槽的I即此旋轉方向時的T，向流通槽的O即H流動。

1.3.3 固定相保留率的測定

將預先平衡好的兩相溶劑體系分離，根據洗脫模式選擇其中一相為固定相，另一相為流動相。先用固定相充滿整個系統，系統總體積記為Vt，然后調節儀器到預定轉速，將流動相以預定流速泵入柱體內，柱體積為Vc，用量筒收集出口端推出的固定相體積。溶劑體系達到平衡時，即出口端無明顯固定相流出，測量推出的固定相體積Ve。固定相保留率的計算如式(1)所示。

1.3.4 黑果枸杞花青素檢測方法

HPLC條件：色譜柱：TSK Gel ODS-80 Ts QA；流速：0.8mL/min；進樣量：20μL；柱溫：35℃；檢測波長：280、350、525nm；流動相：A：10%甲酸＋0.1% TFA；B：85%乙腈＋15%甲醇；梯度洗脫：0～30min，97%～88.5% A；30～40min，88.5% A；40～60min，88.5%～84.5% A；60～70min，84.5%～84% A；70～80min，84%～77% A；80～100min，77%～97% A。

HPLC-MS條件：離子阱質量分析器；ESI電離源；質核比掃描范圍：0～1200m/z；霧化器壓力：241kPa；干燥器流量：8L/min；干燥器溫度：350℃；電離模式：正、負離子兩種模式，并采集MS(1)和MS(2)兩級質譜數據。通過質譜分析獲取物質的分子質量、特征離子碎片等信息。與查閱的文獻相結合，得到物質的分子質量及初步結構信息。

HSCCC條件：溶劑體系：甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸體系；柱轉速：800～1200r/min；流速：1.0mL/min；室溫：28℃；紫外檢測波長：280nm。

2 結果與分析

2.1 研制的圓盤嵌入式螺旋管色譜儀的分離柱

圖1 圓盤嵌入式螺旋管色譜柱Auto CAD設計圖Fig.1 Auto CAD design of spiral tube column

由圖1可知，樣機由2個串聯的色譜柱所構成柱體積為30mL的分離柱，分別對稱設置在J型高速逆流色譜行星架的兩邊，如圖2所示，公轉半徑(R)70mm。根據柱體的設計計算，該逆流色譜儀的β值范圍為0.3～0.7。主機的轉速范圍為800～1200r/min，無極變頻控制。分離柱的轉動由三相異步交流電動機帶動，轉速由變頻器控制，電機允許最高轉速為2500r/min。逆流色譜分離系統管路全部采用PTFE管(D0.8mm)，進樣裝置通過2個六通閥(V541)的交錯連接實現定量環的切換和分離柱管路流向的切換。

圖2 圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜內部結構圖(俯視圖)Fig.2 Vertical view of type J coil planet centrifuge equipped with a spiral tube column

將該圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜與一臺傳統多層纏繞的高速逆流色譜儀進行對比。為尋找合適的對比對象，將原北京市新技術應用研究所研制的一臺小型高速逆流色譜儀的柱體進行改造即重新纏繞管路，保證二者所用管路與β值相同，其柱體積改為35mL；其余參數對比如表1所示，雖然公轉半徑(R)不同，但在后續實驗時可以通過調整轉速(ω)以保證二者可以在相同的離心力(g-levels)下工作，如表2所示，得到可信的對比數據，其中g-levels的計算如式(2)所示。

表1 圓盤嵌入式螺旋管HSCCC與傳統HSCCC基本參數對比Table 1 Fundamental parameters of traditional HSCCC and spiral tube HSCCC

表2 傳統多層纏繞HSCCC與圓盤嵌入式螺旋管HSCCC轉速與對照表Table 2 Revolution speeds and g-levels of traditional HSCCC andspiral tube HSCCC

2.2 兩臺HSCCC在不同溶劑體系下保留能力對比

按照表2所示的傳統多層纏繞HSCCC與圓盤嵌入式螺旋管HSCCC轉速與g-levels的對照表調節轉速進行對比實驗。選取上述4種體系在圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀上的最佳洗脫模式，以相同流速在傳統多層纏繞高速逆流色譜儀上進行對比實驗，結果如圖3所示。圓盤嵌入式螺旋管HSCCC在4種溶劑體系最佳洗脫模式不同g-levels的固定相保留率均比傳統HSCCC高。前者與后者的主要區別在于螺距由1.6mm提高到11.6mm，其Sf有顯著的提高。在L-I-T洗脫模式下，當流速為1mL/min時，傳統多層纏繞色譜柱和圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀在正庚烷-甲醇體系中的固定相保留率(Sf)分別為50%和60%，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的Sf值分別為60%和68%。在U-O-H洗脫模式下，流速為0.5mL/min時，傳統多層纏繞色譜柱和圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀在正丁醇-醋酸-水體系中的Sf值分別為22%和60%；在L-I-T洗脫模式下，流速為0.5mL/min時兩種色譜柱在聚乙二醇1000-磷酸鉀鹽-水雙水相體系中的Sf值分別為15%和46%。

圖3 兩臺HSCCC在不同溶劑體系中不同g-levels對固定相保留率的影響Fig.3 Effect of various g-levels on Sf of HSCCC in various solvent systems

2.3 轉速對兩臺HSCCC保留能力的分析

圖4 在不同體系下Sf對(1/g-levels)1/2回歸分析Fig.4 Regression analysis between Sf and(1/g-levels)1/2 in various solvent systems

對不同溶劑體系下兩臺高速逆流色譜儀Sf對(1/g-levels)做回歸分析，如圖4所示。則：各個體系下Sf對(1/g-levels)1/2均成一定的線性關系，即符合Sf＝a－b(1/g-levels)1/2，與文獻報道的Wood[15]、Berthod[16]等的公式相一致。該回歸分析只考察了Sf穩定之前的數據，即例如聚乙二醇1000-磷酸鹽-水體系下圓盤嵌入式螺旋管HSCCC的保留率在g-levels為78.25g、112.67g、153.38g時均達到了46.67%，因此只考察78.25g之前的數據。采用此方法的原因是在實驗過程中發現，當轉速達到一定值之后，隨著轉速的不斷提高，其固定相保留率Sf并沒有再隨轉速的提高而提高，而是趨于穩定。

2.4 圓盤嵌入式螺旋管HSCCC對黑果枸杞花青素樣品的分離

2.4.1 黑果枸杞色素提取物HPLC檢測和HPLC-MS檢測

圖5 黑果枸杞色素提取物HPLC色譜圖Fig.5 HPLC analysis of Lycium ruthenicum Murr. extract

首先通過HPLC檢測黑果枸杞色素提取物如圖5所示，確認目標物質。由于花青素在525nm波長處有特征吸收，因此選取在525nm波長處吸收最強峰(61min物質)為目標物質進行分離。通過HPLC-MS檢測其分子質量和分子碎片信息，可推斷該物質如圖6所示。其他在280nm檢測波長處基本都可以檢測到，因此后續實驗以280nm進行檢測分析。

圖6 黑果枸杞色素提取物中主要花青素HPLC-MS質譜圖Fig.6 HPLC-MS analysis of predominant anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr. extract

2.4.2 黑果枸杞色素提取物的HSCCC的分離

在流速為1mL/min時，考察圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀對甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(1:2.5:1.5:5:0.001)體系保留能力，如圖7所示。該體系的保留率變化規律為在L-I-T、U-O-H、L-I-H和U-O-T 4個模式下得到相對較高的固定相保留率，最佳洗脫模式為L-I-H與U-O-H，1200r/min(g-levels＝112.67g)保留率均達到40%。在傳統多層纏繞HSCCC采用L-I-H洗脫模式，流速1mL/min，1600r/min(g-levels＝143g)時，此體系Sf僅為10%。因此，使用圓盤嵌入式螺旋管高速逆流色譜儀進行分離時，選取L-I-H的洗脫模式，流速1mL/min，轉速為1200r/min。

圖7 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸體系不同洗脫模式下固定相保留率隨g-levels的變化Fig.7 Sf changes with g-levels in methyl tert-butyl ether:n-butanol:acetonitrile:water: trifluoroacetic acid system under different elution modes

經過不斷調整體系中甲基叔丁基醚、正丁醇和乙腈的比例，以期得到最佳的分離效果，如圖8所示為調整后體系為甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(體積比2.5:1.5:1:5:0.001)的最佳分離效果圖，其固定相Sf為67%；圖9為HPLC檢測圖8中各個組分在280nm波長處的色譜圖。可以明顯看到洗脫出4個組分，主要成分集中在2號，組分純度為89%。

圖8 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸體系(2.5:1.5:1:5:0.001)分離黑果枸杞花青素Fig.8 Separation of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr.extract using methyl tert-butyl ether:n-butanol:acetonitrile:water:trifluoroacetic acid system system

圖9 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸體系分離的黑枸杞花色素組分1～5的280nm波長處HPLC色譜圖Fig.9 HPLC analysis of five separated anthocyanin fractions

3 結 論

由于實驗條件的限制，螺距只有1.6mm和11.6mm兩個參考數值，但是從實驗結果分析，由于改變螺距，使HSCCC對溶劑的保留率得到了極大的改善和提高，并且成功應用于黑果枸杞花青素樣品的分離，這在傳統多層纏繞HSCCC上是無法實現的。在實驗過程中基本選定溶劑體系的情況下，在儀器運行參數粗選的基礎上進行色譜柱轉速、流動相流量等運行參數的優化。由于轉速達到一定值后，固定相保留率趨于恒定值，而且轉速越高，越易產生乳化現象，因此實驗過程應該采用適當的轉速，盲目的提高轉速，以降低儀器的使用壽命為代價而換取更高的Sf不可取。在HSCCC的柱體上進行優化設計，為提高HSCCC的固定相保留率提供了一種有效的途徑，證明通過改變柱體的設計來增加Sf行之有效；在選取體系為甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(體積比2.5:1.5:1:5:0.001)的情況下分離得到了純度為89%的黑果枸杞花青素樣品。

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Spiral Tube High-Speed Counter-Current Chromatography and Its Application in Separation of Anthocyanins fromLycium ruthenicumMurr.

PEI Hai-run，CAO Xue-li*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

A type-J coil planet centrifuge with a 7.0 cm revolution radius was designed through the tandem connection of two spiral tubes. Theβvalue was in the range of 0.3－0.7. The total column capacity was 30 mL. Different polarity solvent systems such asn-heptane:methanol,n-hexane:ethyl acetate:methanol:water,n-butanol:acetic acid:water and PEG 1000:K2HPO4:water were used to comparatively study the retention capacities of the new HSCCC and the traditional multilayer coil HSCCC. The stationary phase retention factor (Sf) of the traditional multilayer coil HSCCC was 50% inn-heptane:methanol system and 60%inn-hexane:ethyl acetate:methanol:water system at a flow rate of 1 mL/min under the L-I-T elution mode, while for the spiral tube HSCCC, theSf values were 60% and 68%, respectively. TheSf values of the traditional multilayer coil HSCCC and the spiral tube HSCCC were 22% and 60% inn-butanol:acetic acid:water system at a flow rate of 0.5 mL/min under the U-O-H elution mode and 15% and 46% in PEG 1000:K2HPO4:water system at the same flow rate under the L-I-T elution mode, respectively. An excellent linear relationship betweenSf and (1/g-levels)1/2was achieved using each investigated solvent system. The new HSCCC was applied to separate anthocyanins fromLycium ruthenicumMurr. using a highly polar system composed of methyl tert-butyl ether,n-butanol, acetonitrile, water and trifluoroacetic acid (2.5:1.5:1:5:0.001), and the results showed that anthocyanins with a purity of 89% were obtained at a flow rate of 1 mL/min.

high-speed counter-current chromatography；spiral tube column；aqueous two-phase system；anthocyanins

TS207.3

A

1002-6630(2012)11-0001-07

2011-08-17

國家自然科學基金項目(20877005)

裴海閏(1984—)，男，碩士，研究方向為生物分離技術。E-mail：peihairun@th.btbu.edu.cn

*通信作者：曹學麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向為生物分離技術。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn