少腹逐瘀湯含藥血清對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜分泌MMP-2和MMP-9的影響

楊東霞，吳修紅，叢慧芳，匡海學(xué)＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis EMS）是一種常見(jiàn)的婦科疾病，主要指子宮內(nèi)膜在子宮腔被覆面以外的地方種植生長(zhǎng)，是一種具有侵襲性的良性病變。其發(fā)病機(jī)制不清，最為推崇的是1972年Sampson等提出的經(jīng)血逆流、內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)及機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)異常理論。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，逆流到腹腔的子宮內(nèi)膜可以在腹腔內(nèi)種植、生長(zhǎng)。經(jīng)血逆流在生育期婦女非常普遍，發(fā)生率可高達(dá)90%，而EMs的患病率僅占20%左右［1］，因此推斷經(jīng)血逆流只是誘因，逆流入腹腔的內(nèi)膜組織必須降解基底膜和其他細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar-matrix.ECM）才能植入。而MMPs是ECM降解過(guò)程中最為重要的一組蛋白酶，幾乎能降解ECM的所有成分，是異位內(nèi)膜侵襲并種植于腹膜的關(guān)鍵。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討少腹逐瘀湯對(duì)在位內(nèi)膜MMP-2和 MMP-9表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本采集

原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜取自2007年7月-2010年7月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院因子宮肌腺癥伴盆腔子宮內(nèi)膜異位癥行子宮切除標(biāo)本，年齡25～49歲，術(shù)前6個(gè)月未用激素治療，子宮切除后立即進(jìn)行內(nèi)膜組織的刮取。

1.2 方法

（1）子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代：參照Ryan等［5］方法，略有改動(dòng)。將得到的子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于預(yù)先放置無(wú)菌玻片的6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液用含10%胎牛血清的 DMEM／F12培養(yǎng)液（GIB-COL BRL產(chǎn)品），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞融合成片后用0.25%胰酶消化傳代。

（2）不同濃度少腹逐瘀湯對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞 MMP-2和MMP-9的影響將子宮內(nèi)膜細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)3天后加少腹逐瘀湯含藥血清濃度分別為4%，8%，設(shè)不加少腹逐瘀湯含藥血清的細(xì)胞組作為對(duì)照。每組6孔，于加藥后72h檢測(cè)MMP-2和MMP-9。

（3）處理好的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后，加Trizol提取總RNA?？俁NA用DNaseⅠ消化處理后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）將1μg純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，稀釋成10μL，作為反應(yīng)的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用從TaKaRa公司購(gòu)置的SYBR Premix EX TaqTM，OPTICON2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（MJ Research?）上進(jìn)行。檢測(cè)中以對(duì)照組、少腹逐瘀湯含藥血清高劑量組、低劑量組cDNA為模板，分別擴(kuò)增MMP-2和MMP-9基因及內(nèi)參基因GAPDH（引物序列見(jiàn)表1）。每個(gè)反應(yīng)均設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30s→熱循環(huán)95℃5s，58℃20s（共40個(gè)循環(huán)）。循環(huán)結(jié)果后，完成融解曲線(xiàn)，以檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物的純度。通過(guò)計(jì)算2-△△Ct值來(lái)確定該基因在不同濃度藥物處理下的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目標(biāo)基因及內(nèi)標(biāo)基因GAPDH熒光定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

少腹逐瘀湯含藥血清對(duì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響：對(duì)各濃度處理的細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的影響，計(jì)算少腹逐瘀湯含藥血清處理各組相對(duì)于對(duì)照組的MMP-2mRNA和 MMP-9mRNA表達(dá)水平，可見(jiàn)少腹逐瘀湯含藥血清對(duì)MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性抑制作用（P＜0.05），MMP-2基因分別下調(diào)表達(dá)0.8和0.39倍；MMP-9基因分別下調(diào)表達(dá)0.57和0.27倍。見(jiàn)圖1。

圖1 少腹逐瘀湯含藥血清對(duì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥具有類(lèi)似惡性腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的能力，在以往的腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲研究中證明細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）及基底膜（basement membrane，BM）的降解和重塑在這個(gè)過(guò)程中主要依靠蛋白水解酶的作用，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是其中最為重要的一組蛋白酶。MMPs是一個(gè)高度保守依賴(lài)于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解ECM和BM的大多數(shù)蛋白［2］。目前發(fā)現(xiàn)的 MMPS有26余種 ，根據(jù)作用的特異性底物不同 ，可分為5大類(lèi)：①間質(zhì)膠原酶 （MMP-1、MMP-8、MMP-13），底物主要為纖維性膠原 ；②明膠酶類(lèi)（MMP-2、MMP-9），底物主要是明膠、IV／V型膠原 ；③間質(zhì)溶解素類(lèi) （MMP-3、MMP-7、MMP-10），底物主要是層粘連蛋白、纖維性蛋白、多糖核心蛋白及III、IV、XI型膠原；④膜型金屬酶類(lèi) （MMP-14、MMP-15、MM P-16、MMP-17），底物主要為I、II、III、IV 型膠原；⑤其它 （MMP-11、MMP-12），底物為al蛋白酶及彈性蛋白［3］。在正常穩(wěn)定狀態(tài)組織中MMPS表達(dá)極少，而在炎性細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子的刺激下以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中 ，其表達(dá)量上升 ，此過(guò)程涉及人體多種生理和病理過(guò)程 ，如炎癥、胚胎發(fā)生、血管形成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等。在人的正常子宮內(nèi)膜組織中，不同的MMPs在月經(jīng)周期中的表達(dá)不同，在月經(jīng)期及增殖早期，伴隨著內(nèi)膜組織的崩解和重建，MMPs呈高表達(dá)，而在分泌期，MMPs水平因受到孕激素的抑制而有所下降［4］。任何能夠?qū)е翸MPs和TIMPs表達(dá)失衡的原因，均可加快異位內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重建，進(jìn)而增進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，為異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖提供了前提條件。

少腹逐瘀湯源于清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有溫經(jīng)散寒、理氣止痛，并引諸藥直達(dá)少腹的功用，是臨床上治療子宮內(nèi)膜異位癥的常用方。為探討該方治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察少腹逐瘀湯含藥血清對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜細(xì)胞分泌的AMMP-2和MMP-9作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)少腹逐瘀湯能明顯抑制在位內(nèi)膜細(xì)胞MMP-2和MMP-9的分泌。從蛋白酶免疫角度，我們推測(cè)，少腹逐瘀湯可能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)，抑制了內(nèi)異癥患者在位異常增高的MMP-2，9的表達(dá)及分泌，調(diào)節(jié)MMPs和TIMPs之間的平衡失調(diào)，降低了逆流至腹腔的內(nèi)膜其蛋白水解能力，使其種植能力下降，并減弱了其促血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的功能，干擾了內(nèi)異癥形成的“3A”病理過(guò)程，減少了病灶的產(chǎn)生。這可能是少腹逐瘀湯控制內(nèi)異癥病情發(fā)展的機(jī)制之一。

［1］ANGER D L，F(xiàn)OSTER W G.The link between environmental toxieant exposure and endometriosis［J］.Front Biosci，2008，13：1578-1593.

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［3］CURRY JR TE，OSTEEN KG.Cyclic changes in the matrix metallo proteinase system in the ovary and uterus［J］.Biol Rep rod，2001，64：1285-1296.

［4］SIVRIDIS E，GIATROMANOLALI A.New insights into the normal menstrual cycle-regulatory molecules［J］.Histol Histopathol，2004，19（2）：511-516.