九節龍皂苷衍生物對腦膠質瘤U373細胞株及裸鼠移植瘤的影響

王 榮，校 鑫，林 瑤，張 磊，王曉娟*

（1.第四軍醫大學口腔醫學院藥劑科，陜西 西安 710032；2.第四軍醫大學西京醫院神經外科，陜西 西安 710032）

皂苷是廣泛存在于自然界的一類活性物質，其抗腫瘤作用一直是研究的熱點。研究表明，皂苷抗腫瘤作用的靶點和途徑廣泛多樣，有很好的研究和開發前景［1］。

九節龍皂苷 (Ardipusilloside，ADS)是本課題組最早從川產九節龍Ardisia pusilla A.DC中分離得到的具有自主知識產權的先導化合物，該化合物具有抗腫瘤作用［2-3］，特別是對腦膠質瘤具有明顯的抑制作用［4-8］，可引起膠質瘤細胞凋亡，且不影響腦內正常支持細胞，具有廣闊的開發前景，已獲專利4項。在原有的結構基礎上，對九節龍毛苷進行了一系列的結構修飾，經過MTT法篩選，九節龍皂苷修飾物ADS003較九節龍皂苷有更好的抗腫瘤效果。本實驗擬觀察ADS003對體外培養的腦膠質瘤U373細胞的抑制作用，從分子水平探討其抑瘤作用機制；并通過建立裸鼠移植瘤模型，考察ADS003對瘤體以及caspase表達的影響，從體內外探討ADS003的抑瘤作用機理。

1 材料和方法

1.1 細胞株 膠質瘤U373細胞系由第四軍醫大學西京醫院全軍神經外科研究所提供。于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素、0.37%NaHCO3、0.42%Heppes的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA(ethylenediamineetraacetic acid)消化傳代。

1.2 藥品、試劑及儀器 九節龍皂苷衍生物003［(ADS003)，自制，純度＞92%］；DMEM培養基(美國Invitrogen公司)；胎牛血清 (美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍 (methyl thiazolylterrazaium，MTT)(美國Sigma公司)；兔抗Caspase3、Pho-Caspase3單抗、山羊抗兔二抗 (美國Santa ctruz公司)；DAB顯色液 (北京中衫公司)。

CO2培養箱 (美國Thermo公司)；空氣凈化臺(蘇州凈化設備廠)；酶聯儀、電泳儀 (美國Bio-Red公司)；凝膠成像系統 (美國Alpha Innotech公司)；雙速恒溫振蕩器 (太倉市科教器材廠)；低溫高速離心機 (美國Beckman公司)；pH值測定儀 (德國Sartorius公司)。

1.3 動物 成年雄性BALB/c裸鼠(6周，25 g)，購自第四軍醫大學實驗動物中心。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測ADS003對U373細胞增殖的影響取對數生長期U373細胞，稀釋成2×104/mL的單細胞懸液，接種至96孔板內，培養24 h，吸取陪養液、棄掉，加入含不同ADS003質量濃度 (2、4、8、16、32、64、100 mg/L)的培養液，培養24、48、72 h。隨后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，繼續培養4 h，吸取上清、棄掉，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min。酶標分析儀檢測490 nm波長的光密度值。抑制率 (%)=(A對照組－A實驗組)/A對照組×100%。

2.2 流式細胞術 (flow cytometry，FCM)檢測凋亡細胞 將U373細胞接種于4個100 mL培養瓶中培養24 h，將培養液換成含ADS003的培養液，繼續培養24 h。消化細胞，加入含血清的完全培養基。輕微吹打使細胞脫壁，500 r/min離心5 min收集細胞，吸取上清、棄掉，用PBS洗滌細胞2次。后續步驟按照Annexin V FITC試劑盒說明書進行操作，用流式細胞儀定量分析細胞凋亡水平。

2.3 免疫細胞化學實驗 取對數生長期U373細胞，稀釋成2×104/mL的單細胞懸液，接種至放有蓋玻片的6孔板內。細胞帖壁后，吸取培養液、棄掉，加入含ADS003培養液，繼續培養24 h。然后用PBS清洗3次，0.3%的 H2O2封閉20 min，加入Triton-100(0.15%)破膜10 min，PBS清洗3次，加入一抗4℃過夜，加入二抗，按DAB操作步驟過缸，樹膠封片。結果判讀以胞漿被染成棕色判為陽性細胞。每張片子隨機選擇8個視野，采用image pro plus 6.0分析灰度值。

2.4 實體瘤動物模型的建立 取對數生長期的U373細胞，消化，獲得單細胞懸液，檢測細胞活率達95%～98%。離心沉淀細胞，生理鹽水重懸，調節密度至5×107個/mL。成年雄性BALB/c裸鼠40只，碘仿消毒，每只100 μL，接種于裸鼠背部皮下，飼養于第四軍醫大學口腔醫院實驗動物中心。

2.5 實驗分組及給藥 接種后，待瘤塊長徑為10 mm左右，將成瘤的40只裸鼠隨機分為陰性對照組，ADS003低、中、高劑量組 (12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg)，每組10只。次日 (d1)開始給藥，藥物均以生理鹽水稀釋，灌胃給藥，每3日1次，以游標卡尺分別測量瘤塊長徑 (a)和短徑 (b)，計算體積 (v)=a×b2/2。藥后15 d，處死，剝離瘤塊，稱質量，計算抑瘤率［9］。

2.6 免疫組織化學 取瘤塊，制作蠟塊，切片，常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。用甲醇新鮮配制的0.3%雙氧水滅活內源性過氧化物酶，用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進行抗原修復。10%正常山羊血清封閉液37℃溫育30 min，滴加稀釋后的一抗4℃過夜，加入二抗，按DAB操作步驟過缸，樹膠封片。顯微鏡觀察并照相。

2.7 統計學分析 所得數據用SPSS13.0軟件計算均數及標準差，并進行方差分析，組間差異采用Dunnett-t檢驗。實驗數據用均值±標準差 ()表示。

3 結果

3.1 ADS003對U373細胞的細胞毒性 不同質量濃度ADS003對U373細胞生長的抑制作用如圖1所示，隨著ADS003質量濃度的增加，對U373細胞的抑制作用明顯增強；隨著藥物作用時間的延長，ADS003對膠質瘤細胞的抑制作用也呈現增強趨勢。

圖1 不同質量濃度九節龍皂苷合成物對U373細胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibit effect on proliferation of U373 cells treated with different concentrations of ADS003

3.2 FCM實驗結果 采用FCM定量分析正常對照組和ADS003處理24 h后U373細胞的凋亡率。結果如表1所示，與正常U373細胞相比，ADS003處理組隨質量濃度增加U373細胞凋亡率明顯增加(P ＜0.01)。

3.3 免疫細胞化學實驗結果 ADS003作用24 h后，腦膠質瘤U373細胞中Caspase3、p-Caspase3均在胞漿中高表達，并隨著藥物質量濃度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達增加，與陰性對照組比較，有顯著差異 (P＜0.01)。見表2。

表1 九節龍皂苷衍生物隨質量濃度變化對U373細胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

表1 九節龍皂苷衍生物隨質量濃度變化對U373細胞凋亡的影響Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

注:與對照組相比，*P＜0.05；與對照組相比，#P＜0.01。

組 別 質量濃度/(mg·L－1)細胞樣本數/個OD值 細胞凋亡率/%陰性對照組 － 6 0.876±0.03 －ADS003高劑量組 15.0 6 0.636±0.04 61.26*#ADS003中劑量組 10.0 6 0.437±0.03 49.98*#ADS003低劑量組 5.0 6 0.177±0.03 20.24*

表2 九節龍皂苷衍生物隨質量濃度變化對Caspase3、p-Caspase3的免疫細胞化學的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

表2 九節龍皂苷衍生物隨質量濃度變化對Caspase3、p-Caspase3的免疫細胞化學的影響Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

注:與對照組相比，*P＜0.05；與對照組相比，#P＜0.01。

陰性對照組 － 8 0.1322±0.026 0.1155±0.029 ADS003高劑量組 15.0 8 0.4778±0.018 0.5320±0.018*#ADS003中劑量組 10.0 8 0.3021±0.034 0.3196±0.031*ADS003低劑量組5.0 8 0.1418±0.012 0.1321±0.022

3.4 對裸鼠移植性實體瘤模型的抑制作用 與對照組比較，ADS003在12.5～50 mg/kg能顯著抑制裸鼠荷瘤U373細胞的生長，其抑瘤率45.9%～55.8%；ADS003能顯著抑制荷瘤鼠體質量的增長(P＜0.01)。見圖2。

圖2 不同質量濃度九節龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373細胞生長的抑制作用Fig.2 The inhibit effect on proliferation of U373 cells bearing mice with different concentrations of ADS003

3.5 ADS003對裸鼠移植性實體瘤Caspase表達的影響 腫瘤組織經DAB染色，細胞核染成淡藍色，Caspase3、p-Caspase3位于胞漿中，被染成褐色。如圖3、圖4所示。不同劑量ADS003作用后，隨著藥物質量濃度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達逐漸增加。

圖3 九節龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373細胞p-Caspase3表達的影響Tab.3 Effects of ADS003 on expression of Caspase3 and p-Caspase3 in U373 cells bearing mice

圖4 九節龍皂苷衍生物對裸鼠荷瘤U373 Caspase3表達的影響Tab.4 EffectsofADS003onexpressionofp-Caspase3 in U373 cells bearing mice

4 討論

通過對活性先導化合物進行結構修飾發現新的活性成分是創制新藥的有效途徑之一［10］。本課題所采用的ADS003即是以九節龍皂苷為先導物，對其30位醛基進行結構修飾所得的產物，前期實驗結果顯示，該修飾物具有明顯的抗腫瘤活性。但其具體抗腫瘤分子機制還有待研究。

本研究通過體內外實驗證實了ADS003對腦膠質瘤U373的抑制作用。體外培養的人腦膠質瘤U373細胞經ADS003處理后，隨著藥物濃度的增加膠質瘤細胞增殖受抑制的作用越明顯；隨著藥物作用時間的延長，抑制作用增強，呈現時間和劑量依賴性。FCM實驗證實ADS003可劑量依賴性的促進U373細胞凋亡，免疫細胞化學實驗結果表明ADS003誘發U373細胞凋亡與其促進凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表達有關。通過對裸鼠移植性實體瘤模型研究發現，ADS003能抑制腫瘤生長，免疫組化實驗結果表明經ADS003給藥后，上調了Caspase3、p-Caspase3的表達。

腫瘤的發生是多因素相互作用、極其復雜的過程，而藥用植物中的活性成分可通過多種途徑、多個靶點發揮其生物學作用，成為目前研究的熱點和重點［11］。ADS003是九節龍皂苷的修飾物，本實驗從體內外兩方面證實了其抑瘤機理，ADS003能夠抑制腫瘤細胞的生長，呈劑量依賴性；并能夠誘發腫瘤細胞發生凋亡，這種作用機制極可能是通過上調促進凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3，誘發U373細胞大量凋亡，發揮重要的抗腫瘤作用。綜上所述，上述研究結果為該藥進一步的研究提供可靠的實驗證據和立論依據。

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