正交試驗優選玄參蒸制中試工藝的研究

曹 崗，季金玉，叢曉東*，張 云，蔡寶昌，3，4*

（1.浙江中醫藥大學中藥炮制技術研究中心，浙江 杭州 310053；2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046；3.南京中醫藥大學國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210029；4.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061）

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，始載于《神農本草經》，玄參主要分布于東北、華北與華東地區。玄參為咸寒之品，質潤多液，功能滋陰降火、解毒、利咽等，為臨床常用中藥。玄參主要含環烯醚萜苷類、苯丙素苷類、芳香糖苷類等，其中環烯迷萜苷類和苯丙素苷類成分的含有量都非常高［1］。《中國藥典》2010年版收載蒸透或潤透，文獻報道，玄參炮制以直接蒸制的方法為好［2-3］，但目前采用的蒸制工藝缺乏客觀可控性較強的工藝參數，質量難以得到完善系統的控制。玄參蒸制后，5-羥甲基糠醛 (5-HMF)的量較生品中明顯增加。研究表明，5-羥甲基糠醛具有多種生物活性［4-5］，對玄參炮制工藝及機制的研究具有重要意義，且尚未見文獻報道。

中試是在大規模產量前的較小規模試驗。中試的目的是驗證、復審和完善實驗室工藝所研究確定的反應條件，研究選定的飲片工業化生產設備結構、材質、安裝和車間布置等，為正式生產提供數據。本實驗采用蒸制法炮制玄參，以哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛和浸出物作為指標，在中試規模上，運用現代飲片工業設備，采用正交試驗優選玄參最佳蒸制工藝參數，為更好地控制玄參炮制品質量提供了依據。

1 儀器及試藥

Dionex UltiMate 3000型系列高效液相色譜儀(美國 Dionex公司)；KQ—250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL—16C高速臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠)；AL204電子天平；XS105分析天平 (梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司)；蒸藥箱 (杭州春江自動化研究所)；往復式切藥機。

乙腈、甲醇 (色譜純)、水 (重蒸水)，其他試劑均為分析純；哈巴俄苷對照品 (批號111730-200604)購自中國藥品生物制品檢定所，5-羥甲基糠醛對照品 (批號 H40807—250MG)購自 US ALDRICH chemistry。玄參藥材由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供，經浙江中醫藥大學張云主任中藥師鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。

2 方法與結果

2.1 樣品中哈巴俄苷及5-羥甲基糠醛的測定［6］

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.03%磷酸水溶液 (A)-乙腈 (B)；檢測波長為280 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。在該色譜條件下，5-羥甲基糠醛及哈巴俄苷與其他峰達基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 玄參生品、制品及混標色譜圖Fig.1 Chromatograms of crude，processed Scrophulariae Radix and mixed reference substances

2.1.2 對照品貯備液的制備 分別精密稱取哈巴俄苷對照品 0.204 mg和 5-羥甲基糠醛對照品0.340 mg置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取玄參樣品粉末約0.5 g，加入50 mL的50%甲醇，稱質量，靜置1 h，超聲45 min，補足損失質量，過濾，取續濾液，離心即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1.25、5、7.5、10、12.5、15 μL依次注入液相色譜儀進行分析，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，進行線性回歸計求得回歸方程。5-羥甲基糠醛的回歸方程 Y=16688.6398X+0.3185385，r=0.9999；哈巴俄苷的回歸方程Y=24831.9316 X－0.0714074，r=1(n=6)；其結果表明5-羥甲基糠醛與哈巴俄苷分別在0.00425～0.05100 μg、0.00255～0.03060 μg進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取玄參供試品溶液10 μL，連續進樣5次，測定各組分的峰面積值(n=5)，計算得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為0.51%和1.19%。

2.1.6 穩定性試驗 取同一批供試品，按樣品測定項下的方法制成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定各組分的峰面積值，計算得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為2.35%和1.85%(n=5)。結果表明，供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批供試品，平行制備5份，按樣品測定項下的方法操作，進樣10 μL，在上述色譜條件下分別測定，求得哈巴俄苷和5-羥甲基糠醛的RSD分別為0.82%和2.84%(n=5)。實驗結果表明，本法重復性良好。

2.2 炮制方法

2.2.1 生玄參的制備 取原藥材，去除多余根莖，洗凈，晾干，即得玄參樣品。

2.2.2 蒸制玄參的制備 取生玄參45 kg，平均分成9份，按照L9(34)正交表安排，置蒸藥機中蒸制，蒸透后稍晾，切薄片。

2.3 正交試驗設計安排 《中國藥典》2010年版收載的蒸制玄參，由于其中沒有具體可量化的操作工藝參數，給生產和質量控制帶來不便，因此本試驗選用智能化控制蒸藥機，采用正交設計來對浸泡時間、蒸制時間、干燥溫度進行優選。參考文獻的基礎上，以浸泡時間 (A)、蒸制時間 (B)和干燥溫度 (C)為考察因素，每個因素取3個水平，以哈巴俄苷、5-羥甲基糠醛的含有量及浸出物得率為指標綜合進行玄參蒸制工藝的考察。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

浸出物測定按照《中國藥典》2010年版附錄中水浸出物測定的方法進行測定。將各樣品浸出物的量和總量最高的那一項值定為100分，把各號樣品的浸出物和含有量轉化為分數。綜合加權評分，采用正交設計助手V3.1版計算機軟件分析數據，數據見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交試驗結果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal test

結果顯示:C因素有顯著性差異，故C因素確定為3水平，即干燥溫度95℃；A因素影響較小，由直觀分析為3水平，即泡30 min。B因素無顯著性差異，考慮到蒸制目的是便于切片，結合直觀分析確定為2水平，即蒸2 h。因此，最終確定最佳中試蒸制工藝為A3B2C3。

2.4 蒸制工藝驗證 按照優選出的玄參炮制工藝條件即浸泡30 min、蒸制2 h、干燥溫度95℃，分別制備3批樣品并測定各指標成分。所制備的玄參飲片性狀好，測得樣品飲片整體性狀較好，所得樣品浸出物得率分別為 71.29%、71.32%、71.26%，5-羥甲基糠醛含有量分別為0.195%、0.197%、0.195%，哈巴俄苷的含有量分別為0.173%、0.169%、0.170%。見表4。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 3批玄參蒸制品中5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的測定Tab.4 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in three processed products of Scrophulariae Radix

2.5 玄參炮制前后5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物測定及比較 方法同前，結果見表5。玄參蒸制后哈巴俄苷與浸出物變化不明顯，但5-羥甲基糠醛的含有量劇增。

表5 玄參生品與蒸制品中5-羥甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的測定Tab.5 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in crude and processed products of Scrophulariae Radix

3 討論

本實驗在在進行色譜分析時，采用了幾種流動相進行實驗，以確定最佳流動相。實驗過程中選擇了多種流動相系統:甲醇-水；乙腈-水；乙腈-0.1%甲酸；乙腈-0.3%磷酸進行梯度洗脫。結果表明，甲醇在較低波長處吸收較強，梯度洗脫時基線漂移嚴重，而乙腈-水體系相對較好，另外在酸性條件下有較好的色譜峰分離，而故實驗選取乙腈-0.3%磷酸為流動相。結果表明酸性環境有利于各色譜峰的分離，但采用乙腈-0.1%甲酸時基線漂移且噪音明顯，故實驗選取乙腈-0.3%磷酸為流動相。

中藥指標成分在炮制加工成飲片的過程中有所損失時不可避免的，實驗結果顯示，優化的蒸制工藝條件對玄參中主要成分哈巴俄苷的含有量影響很小。且玄參生品中5-羥甲基糠醛含有量很低，而蒸制品中含有量顯著增加。它主要是由己糖經加熱分解產生，廣泛存在于含有糖類物質的植物和食品中，一般在炮制或加熱后其含有量會增加。5-羥甲基糠醛是玄參炮制前后含有量變化極其顯著的物質，文獻報道這一被認為有一定副作用的物質具有增強大鼠紅細胞變形活性及抗氧化、改變血液流變學等對人體有益的作用，可能是一種曾被人們忽視的活性成分。前期研究表明它可以抗氧化、保護血管內皮細胞改善血管微循環、保護肝細胞和促進免疫系統功能，化學研究結合藥理研究可推測其可能是玄參炮制增效的物質基礎之一。

目前，中藥材炮制工藝大多缺乏科學合理的技術參數，且實驗室研究的工藝參數放大至工業生產上就會有一定的偏差，因此實驗室工藝無法直接應用于工業化生產。因此，在中試規模上，采用自動化蒸藥機研究玄參炮制品的工藝參數具有理論和實際應用兩方面意義。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:108-109.

［2］Hou Y C，Ching H，Chao P D，et al.Effects of glucose，frutose and 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde on the presystemic metabolism and absorption of glycyrrhizin in rabbits［J］.J Pharm Pharmacol，2005，57(2):47-25.

［3］Matsuda H，Tsukioka Y，Moriyama K，et al.Studies on Rehmanniae Radix V.5-hydroxymethyl-2-furaidehude，active constituent of the steamed root of Rehmannia glutinosa having increasing activity of erythrocyte deformability in rats［J］.Nat Med，2004，58(1):34-37.

［4］張發科，呂青濤，張兆旺，等.HPLC法研究不同工藝對玄參中哈巴俄苷和肉桂酸含量的影響［J］.化學分析計量，2006，15(6):51-53.

［5］丁 霞，王明艷，余宗亮，等.山茱萸中5-羥甲基糠醛的分離鑒定及生物活性研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(4):392-395.

［6］曹 崗，季金玉，叢曉東，等.玄參蒸制不同時間5-羥甲基糠醛的含量比較［J］.中國新藥雜志，2012，21(8):936-938.