夏天無注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬Ang-2和VEGF mRNA表達的影響

曠明麗，余麗梅，張 駿*，吳 芹

（1.遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563003；2.遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003；3.遵義醫學院貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州 遵義 563003）

缺血性腦卒中是臨床常見的急性腦血管疾病，其發病率、病死率及致殘率很高，故對其防治十分重要。在腦梗死中心壞死區周圍存在缺血半暗帶，其大量的腦細胞處于休眠或半休眠狀態，如在一定的治療時間窗 (1～3 h)內通過有效的治療，使原來閉塞的腦動脈血管重新通暢或建立新的側枝循環，則可使它們的神經功能得到逐漸恢復。

夏天無注射液是從中藥中提取的中藥注射劑，主要含有普魯托品等有效成分，臨床已用于治療腦血管病后遺癥、坐骨神經痛、風濕性關節炎等疾病。研究表明夏天無中提取的夏天無總堿可抑制大鼠血栓形成，減輕腦栓塞引起的腦水腫［1］；對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，可減輕氧化損傷［2］。夏天無注射液對腦缺血損傷也具有保護作用，并可抑制神經元凋亡等［3］，還可增加血管性癡呆大鼠海馬血管生成素-1的表達［4］。本研究制備大鼠腦缺血再灌注模型，觀察夏天無注射液的保護作用，同時分析對大鼠海馬血管生成相關的血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)和血管內皮細胞生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的影響，以探討夏天無注射液的可能的作用機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 夏天無注射液 (批號:06102001，2 mL含阿片堿0.4 mg)系江西天施康中藥股份有限公司產品；尼莫地平注射液 (批號:0203011，2 mg/10 mL)為山東新華制藥股份有限公司產品；TTC購自上海山蒲化工有限公司；組織細胞RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；RT試劑盒、Trizol試劑購自TaKaRa生物工程公司(試劑型號:D312)；Ang-2 mRNA引物由美國Sigma公司合成；SYBR GREEN PCR Master Mix為美國ABI公司產品；0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)滅菌水、乙醇、異丙醇、三氯甲烷等試劑為國產分析純。

1.2 主要儀器 SHZ-88A往復式水浴恒溫器 (江蘇太倉市實驗設備廠)；電子天平 (德國賽多利斯公司)；TU-1810紫外分光光度計 (北京普析通用分析儀器公司)；XW-80A旋渦混合器 (寧波新芝科器研究所)；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機及逆轉錄儀 (德國 Eppendorf)；BeckMAN CoulTER離心機 (美國貝克曼公司)；iCycler熒光定量PCR儀 (美國BIO-RAD)；－80℃低溫冰箱 (日本三洋公司)。

1.3 動物 雄性SD大鼠，體質量250～300 g，由第三軍醫大坪醫院動物中心提供，均為清潔級動物［生產許可證號:SCXK(渝)20020004］，手術前大鼠分組飼養，自由飲食。

2 方法

2.1 MCAO模型的制備和分組 20% 水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠 (0.18 mL/kg)，分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈等，參照文獻 ［5］，線栓法制備大腦中動脈阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，阻斷大腦中動脈血液供應，結扎固定線栓，縫合皮膚切口，栓線外留10 mm。待缺血2 h后再輕拉線頭，使栓線頭端退至頸總動脈切口處，實現再灌注22 h，術中室溫保持在25℃。假手術組栓線插入深度為10 mm。

實驗動物分為7組，分別為:正常組、假手術組、模型組、夏天無注射液高 (0.05 mL/kg)、中 (0.025 mL/kg)、低 (0.01 mL/kg)劑量組和尼莫地平 (0.01 mL/kg)對照組，給藥組缺血2 h再灌注前30 min肌肉注射相應藥物各1次，正常組、假手術組及模型組肌肉注射等體積生理鹽水。

2.2 神經功能評價 如表1所示，參考Menzies SA［6］的標準給予評分。缺血2 h后評分在3分及以上者視為模型成功。

表1 腦缺血大鼠神經功能評分

2.3 腦組織梗死面積測定 模型成功者隨機每組取大鼠8只，術后24 h斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干，以冷生理鹽水去表面血跡，置－80℃低溫冰箱中7～8 min，凍成半硬狀，冠狀切片分成腦組織5片，然后迅速將腦片置5 mL含有1%氯化三苯四氮唑 (triphenyltetrazolium chloride，TTC)及0.1 mL含有1 mol/L K2HPO4溶液中，避光37℃溫孵30 min，其間每隔7～8 min翻動一次，染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色；用比重法測定出梗死比重，即梗死腦組織占全腦質量的百分比 (%)=梗死腦組織質量/全腦質量×100%(均為濕質量)。

2.4 RT real-time PCR 按試劑盒說明進行操作，用Trizol試劑和組織細胞RNA抽提試劑盒提取大鼠海馬組織RNA，紫外分光光度計測定D(260)和D(280)，計算D(260)/D(280)比值和RNA濃度，在1.8～2.0范圍內者，按TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒操作說明書，在 Mastercycler Gradient PCR儀逆轉錄獲得cDNA。逆轉錄條件為:37℃15 min，85℃ 5 s。按SYBR GREEN PCR Master MIX(美國ABI公司)操作說明，進行定量 PCR檢測。反應條件:95℃8 min，1 Cycle；95℃ 15 s；60℃ 1 min，40 Cycles；β-actin的退火溫度為60.2℃，VEGF的退火溫度則為55℃。以βactin的mRNA表達水平為100%，計算Ang-2和VEGF mRNA表達水平。所測基因引物序列見表2。

表2 擴增基因引物序列

2.5 統計分析 實驗數據用SPSS 12.0統計軟件統計，所有數據以均數±標準差 ()表示。組間比較 mRNA水平差異大于或等于2倍以上者，t檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

3 結果

3.1 對腦缺血/再灌注大鼠神經功能評分的影響 大鼠腦缺血2 h再灌注22 h后，假手術組和正常組大鼠神經功能評分均為0分；與模型組比較，夏天無注射液中、高劑量組和尼莫地平組均可降低神經功能學評分 (P＜0.05)，而夏天無注射液低劑量組對神經功能評分無顯著改善。且夏天無注射液中、高劑量組降低神經功能學評分作用較夏天無注射液低劑量組顯著 (見表3，P＜0.05)。

表3 對腦缺血/再灌注大鼠神經功能評分的影響(，n=8)

表3 對腦缺血/再灌注大鼠神經功能評分的影響(，n=8)

注:與模型組比較，*P＜0.05；與夏天無注射液低劑量組比較，#P＜0.05。

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3.2 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 大鼠腦缺血2 h/再灌注22 h后，TTC染色結果顯示，假手術組與正常組一樣，未出現梗死灶。與模型組比較，夏天無注射液中、高劑量組和尼莫地平組均可降低腦梗死面積 (分別為P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，而夏天無注射液低劑量組對腦梗死面積無顯著改善。且夏天無注射液中、高劑量組降低腦梗死范圍作用較夏天無注射液低劑量組顯著 (見表4、圖1，P＜0.05)。

表4 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (，n=8)

表4 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (，n=8)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與夏天無注射液低劑量組比較，#P＜0.05。

分組 劑量/(mL·kg－1) 梗死面積/%正常組0.01 0假手術組 0.01 0模型組 0.01 0.32±0.08尼莫地平組 0.01 0.24±0.06*夏天無注射液低劑量組 0.01 0.29±0.07夏天無注射液中劑量組 0.025 0.21±0.05＊＊#夏天無注射液高劑量組 0.05 0.23±0.05*#

3.3 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內Ang-2和VEGF mRNA水平的影響 大鼠腦缺血2 h/再灌注22 h后，與正常組及假手術組比較，模型組及夏天無注射液中、高劑量組海馬組織Ang-2和VEGF mRNA均顯著增高 (P＜0.05)。夏天無注射液中、高劑量組與模型組比較，海馬組織Ang-2 mRNA的表達進一步顯著增加 (見表5，P＜0.05)。

圖1 夏天無注射液對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍的影響 (TTC染色)

表5 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內Ang-2和VEGF mRNA水平的影響(，n=3)

表5 對腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠海馬內Ang-2和VEGF mRNA水平的影響(，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，與正常組、假手術組比較，#P＜0.05。

分組 劑量/(mL·kg－1)mRNA 的表達水平Ang-2 VEGF正常組0.01 32.00±19.73 20.20±12.22假手術組 0.01 33.20±27.13 21.40±22.95模型組 0.01 68.78±10.45# 49.30±12.98#夏天無注射液中劑量組0.025 142.21±19.48*# 127.27±20.43*#夏天無注射液高劑量組0.05 352.85±26.38*# 179.97±24.82*#

4 討論

血管的生成是一個復雜過程，受到許多正負向調節關鍵分子如血管生長因子和抑制血管生長因子的調控，正常生理狀態下，機體內的血管一經新生即保持高度的穩定性。缺血性腦損傷后是否有血管生成是其康復的關鍵之一，涉及原有血管破壞、血管內皮細胞增生、出芽、新生血管形成和構建穩定的血管網絡的過程。VEGF是最常見的血管生長因子之一，可作用于血管內皮細胞的特異性多功能因子，參與腦缺血后腦組織的病理修復過程［7］。腦缺血后，缺血區特別是缺血半暗帶VEGF表達上調刺激了內皮細胞增生，從而形成新的血管，且VEGF貫串血管新生的整個過程，并能在內皮細胞內誘導抗凋亡蛋白，從而維持新生血管中內皮細胞的生存［8］，VEGF還具有減少腦梗死面積，減輕腦水腫的作用［9-10］。

血管生成素/血管生成素受體 (Tie)通路是調節血管生成的另一重要信息途徑，在血管的發生、成熟和維持血管的完整性與穩定性等方面扮演著重要角色［11-12］，可減輕炎癥反應和降低血管通透性等。Ang-2作為血管生成素家族中的一員，由血管內皮細胞合成，參與引發內膜去穩定、打破血管的穩定信號、導致血管消退、啟動血管形成信號、促進血管形成等作用［13］。Ang-2對血管生成的影響與局部微環境有關，當VEGF存在時Ang-2則破壞血管的穩定，迅速重塑血管基底膜，激活內皮細胞增殖、侵襲、遷移、血管出芽、周細胞和平滑肌細胞聚集黏附，形成新生血管，并使血管管徑增粗，通透性增加［14-15］，即參與血管消退、血管形成和血管網的重建；無VEGF時，激活的內皮細胞則發生凋亡，血管發生退行性變，血管的新生受到抑制。

本研究結果顯示，腦缺血/再灌注損傷后，大鼠的神經功能評分明顯增高，出現較大面積的腦梗死，同時發現，海馬組織的Ang-2和VEGF mRNA表達明顯增高，這與文獻報道一致［16-18］，進一步證實在破壞血管穩定和啟動新生血管形成中的Ang-2和VEGF的一致升高。值得注意的是與模型組比較，夏天無注射液治療后，腦缺血2 h/再灌注22 h大鼠的神經功能評分明顯改善，且腦梗死面積明顯縮小，表明夏天無注射液對腦缺血/再灌注損傷具有明顯的保護作用。此外，與模型組比較，夏天無注射液治療組 Ang-2、VEGF mRNA的表達進一步升高，提示:夏天無注射液在促進梗死區血管消退，增強血管新生信號表達，加速血管內皮細胞增生，啟動血管新生方面可能發揮著重要作用。但夏天無注射液在腦缺血/再灌注損傷修復期中是否通過血管生成從而促進損傷后修復值得進一步探討。

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