落地生根總黃酮提取工藝及其清除自由基作用的研究

劉德勝，劉琳琳，劉為忠

（濱州醫學院，山東 煙臺 264003）

落地生根是景天科植物落地生根Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草及根，別名打不死、花蝴蝶等，以全草入藥，全年可采，收錄于《中華本草》；民間多用于創傷出血、癰疽、喉風腫痛及中耳炎等。本研究室前期研究發現其提取物有增強小鼠免疫功能及血液凝固作用［1-2］。

落地生根中含有豐富的黃酮類物質［3］。有研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、抗氧化以及抗輻射等廣泛的藥理活性［4-8］。落地生根的藥用價值很大程度上與其含有的黃酮類成分有關。

自由基具有高度的化學反應活性，其過多或清除過慢，都會加速機體衰老，并且會誘發多種疾病。黃酮類化合物的酚羥基可與自由基反應，從而實現抗氧化作用。利用黃酮類物質開發自由基清除劑是目前國內外十分關注的問題［9］。至今尚無適宜的生產工藝從落地生根中提取高含有量黃酮類化合物的研究報道。本實驗采用單因素試驗和正交設計試驗法篩選醇提取落地生根中總黃酮的最佳工藝條件及其清除OH·和O－2·能力進行評價，為深入研究落地生根的藥理作用和質量控制提供科學依據。

1 儀器和試藥

1.1 儀器及軟件 紫外可見分光光度計 (TU—1901，北京普析通用儀器有限公司)；FA1604s電子天平；超聲波清洗器 (KQ—50E型，昆山市超聲儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機 (Biofuge Primo)；高速粉碎機 (HY—0413，環亞天元機械技術有限公司)。

1.2 藥品與試劑 蘆丁對照品由中國藥品生物制品檢定所提供 (批號:100080-200707)；落地生根 (采自山東煙臺，經濱州醫學院中西醫結合學院劉孟安教授鑒定為景天科植物落地生根 Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草，50℃干燥，粉碎后過60目篩，備用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (純度＞96%，由阿拉丁試劑公司提供)；乙醇為分析純；水 (娃哈哈純凈水)；FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、濃鹽酸、AlCl3、Tris等試劑等均為分析純。

2 試驗方法

2.1 落地生根藥材總黃酮的提取 精稱落地生根粉末約0.5 g，按照1∶15的比例加入石油醚 (30～60℃)，超聲處理30 min，取出后放冷，過濾，棄去石油醚，待藥渣揮干石油醚后，加入適量的一定體積分數的乙醇溶液中，超聲 (功率80 w，頻率50 kHz)輔助下設定溫度、料液比，一定時間后過濾，合并濾液至100 mL量瓶中，藥渣用一定體積分數乙醇洗滌，2～3次，濾液合并到量瓶中，用乙醇定容，搖勻，待用。

2.2 總黃酮含有量的測定 以蘆丁為標樣，采用文獻［10］所述方法測定落地生根中的總黃酮含有量；提取率(mg/g)按照每克 (g)藥材中含有的總黃酮量 (mg)計。

2.2.1 標準溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品 (120℃干燥至恒質量)1.4 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質量濃度為140.0 μg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.2.2 顯色劑溶液的制備 精密稱取AlCl31.0 g，用水溶解并定容至100 mL量瓶中，得質量濃度為10.0 mg/mL的顯色劑溶液。

2.2.3 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液1 mL，供試品溶液1 mL，分別置于10 mL量瓶中，各加質量濃度為10.0 mg/mL的AlCl3溶液0.5 mL，用乙醇定容至10 mL，放置30 min顯色后，以乙醇為空白參比液，在300～700 nm波長范圍測定絡合物的吸光度，絡合物于425 nm波長處有最大吸收，故測定時選用此波長。

2.2.4 標準曲線的制備 取蘆丁對照品溶液 (140.0 μg/mL)，用乙醇稀釋至質量濃度分別為140.0、112.0、84.0、56.0、28.0、14.0 μg/mL的標準溶液，按照2.2.3項下樣品制備方法、于425 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，蘆丁質量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為A=0.0031C+0.0026(r2=0.9996)，表明在14.0～140.0 μg/mL質量濃度范圍內，蘆丁的質量濃度與吸光度線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一質量濃度蘆丁對照品溶液1.0 mL于10 mL的量瓶中，按照2.2.3項下樣品制備方法、于425 nm處測定吸光度，結果RSD為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密吸取同一待測落地生根總黃酮提取液1.0 mL于10 mL的量瓶中，按照2.2.3項下樣品制備方法、于425 nm處測定吸光度，分別于 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h進行測定，結果RSD為0.8%，表明供試品溶液在2.0 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 精密吸取同一待測落地生根總黃酮提取液1.0 mL各6份，置于10 mL量瓶中，按照2.2.3項下樣品制備方法、于425 nm處測定吸光度，結果RSD為1.2%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 分別稱取落地生根粉末約0.5 g，精密稱定，平行6份，按照2.1項下處理方法處理后再加入一定量的蘆丁對照品，在2.2.3項下樣品制備方法制備樣品，在425 nm處測定吸光度，計算回收率為100.4%，RSD為2.7%。

2.2.9 樣品溶液中總黃酮的測定 精密量取樣品溶液1 mL于10 mL量瓶中，按2.2.4項方法進行操作，在波長425 nm處測定吸光度值，由回歸方程計算樣品中總黃酮。

2.3 單因素試驗 選擇對總黃酮含有量有較大影響的乙醇量、料液比、超聲波輔助提取時間和提取溫度為考察因素進行研究，每個因素的不同水平重復3次測定，取平均值。

2.3.1 料液比的篩選 0.5 g落地生根粉末，分別加入70%乙醇，40℃超聲輔助提取20 min，將料液比分別設定在1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進行試驗，按照樣品制備方法制備樣品，測定吸光度，確定合適的料液比。

2.3.2 乙醇體積分數的篩選 0.5 g落地生根粉末，40℃超聲輔助提取20 min，料液比為1∶60，分別用50%、60%、70%、80%的乙醇提取，按照樣品制備方法制備樣品，測定吸光度，確定合適的乙醇體積分數。

2.3.3 提取時間的篩選 0.5 g落地生根粉末，40℃超聲輔助提取，料液比為1∶60，用70%的乙醇提取，選擇提取時間分別為30、60、90、120 min，按照樣品制備方法制備樣品，測定吸光度，確定合適的提取時間。

2.3.4 提取溫度的篩選 0.5 g落地生根粉末，料液比為1∶60，用70%的乙醇提取，超聲輔助提取20 min，設定提取溫度分別為50、60、70、80℃，按照樣品制備方法制備樣品，測定吸光度，確定合適的提取溫度。

2.4 正交試驗 選用料液比、乙醇體積分數、提取溫度、提取時間4個因素、每個因素3個水平，以落地生根總黃酮含有量為考察指標，按照L9(34)正交表 (見表1)設計方案進行試驗，優化提取工藝。

表1 L9(34)正交試驗因素與水平設計

2.5 優化工藝的驗證試驗 為進一步考察正交試驗所得最佳工藝的穩定性和合理性，按優化工藝條件進行試驗，3次重復，求平均值。

2.6 落地生根總黃酮抗氧化試驗

2.6.1 對OH·的清除能力 采用文獻［11］所述水楊酸捕獲法測定試樣液的清除OH·能力。

2.6.2 對超氧自由基的清除能力 采用文獻［12］所述鄰苯三酚自氧化法測定落地生根總黃酮清除超氧負離子的能力。

2.6.3 對有機自由基 (DPPH)的清除作用 按照文獻［13］所述方法測定落地生根總黃酮清除有機自由基的能力。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 料液比對落地生根總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增大，提取效率逐漸增大，但料液比為1∶60和1∶70時相差不大，從節省提取試劑方面考慮，優先考慮料液比為1∶60。

圖1 料液比對提取效果的影響

3.1.2 含乙醇量對落地生根總黃酮提取率的影響 由圖2可知，含乙醇量為70%時，提取效率最高。

圖2 含乙醇量對提取效果的影響

3.1.3 提取溫度對落地生根總黃酮提取率的影響 由圖3可知，提取溫度為70℃時，提取效率最高。

圖3 提取溫度對提取效果的影響

3.1.4 提取時間對落地生根總黃酮提取率的影響 由圖4可知，提取時間為120 min時，提取效率最高。

圖4 提取時間對提取效果的影響

3.2 正交試驗結果 在單因素設計試驗的基礎上，選擇對總黃酮提取率影響較大的料液比、含乙醇量、提取時間和提取溫度，并設計各因素水平，按照表1設計方案進行試驗，以總黃酮提取率為考察指標，結果見表2；方差分析見表3。

表2 優化提取條件正交試驗結果與分析

表3 正交試驗方差分析結果

由表2可知，4種因素對落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A＞B＞D＞C，表明料液比對黃酮含有量的影響是最大的，極差分析結果表明，落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3，即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時間為120 min時提取效果較好。

由表2極差分析結果表明，4種因素對落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A＞D＞B＞C，即料液比對黃酮含有量的影響最大，提取時間、甲醇濃度次之，提取溫度影響最小。由表3方差分析結果可知，料液比 (A)、含乙醇量 (B)、提取時間 (D)對落地生根中總黃酮含有量提取率的影響顯著，而提取溫度 (C)的影響不顯著。因此，落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3，即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時間為120 min時提取效果較好。

3.3 驗證性試驗結果 準確稱取3份干燥的落地生根粉約0.5 g，按最佳工藝條件平行操作，測吸光度，根據回歸方程得出落地生根中總黃酮量，結果見表4。

表4 最佳工藝驗證結果(n=3)

3.4 抗氧化活性試驗結果

3.4.1 落地生根總黃酮對羥自由基的清除率 由圖5可知，落地生根中黃酮對羥自由基清除率隨濃度的增大而增高，當質量濃度為100.5 μg/mL時，清除率能達到96.8%。

圖5 落地生根總黃酮對羥自由基的清除率

3.4.2 落地生根總黃酮對陰負離子的清除率 由圖6可知，落地生根中黃酮對陰負離子清除率隨濃度的增大而增大，當質量濃度為100.5 μg/mL時，清除率能達到26.0%。

圖6 落地生根中黃酮對陰負離子的清除率

4 討論

本實驗所建立并超聲波輔助提取落地生根總黃酮的方法是可行的。有文獻［14］認為落地生根中總黃酮含有量測定應該使用三波長-分光光度法測定；但在前期研究中應用HPLC定量測定落地生根中黃酮類成分含有量時發現，僅槲皮素和山柰酚兩種黃酮含有量已經超過了文獻所述總黃酮含有量，所以本研究采用了先除色素及蛋白后再利用文獻［10］方法進行總黃酮的定量測定。

驗證性實驗結果中，平均產率達到了9.35 mg/g，其中2個樣品的質量分數測定超過9.27 mg/g，說明本研究所建立的最佳實驗方案是可行的。

在抗氧化性活性試驗結果表明，落地生根總黃酮具有一定的抗氧化能力，且黃酮類化合物的添加量在實驗范圍內與其抗氧化性呈正相關。黃酮質量濃度在100.5 μg/mL時，對羥基自由基、超氧自由基的清除作用分別為96.8%、26.0%相差較大，說明落地生根總黃酮對不同類型的自由基清除能力不一致。

［1］徐慶榮，胡學梅，邱世翠，等.落地生根對小鼠免疫功能的影響［J］.中國臨床藥理學與治療學，2002，7(4):317-319.

［2］徐慶榮，胡營濱.中藥落地生根對小鼠血液系統及免疫功能的調節作用［J］.中國臨床康復，2006，10(15):138-140.

［3］曹 宏，夏 杰，徐殿勝，等.落地生根葉中黃酮的分離與鑒定［J］.中藥材，2005，28(11):988-990.

［4］龔金炎，張 英，吳曉琴.黃酮類化合物體外抗病毒活性的研究進展［J］.中草藥，2008，39(4):623-627.

［5］龔金炎，洪 輝，吳曉琴，等.黃酮類化合物的促氧化作用及其細胞毒性研究進展［J］.中草藥，2008，39(12):1905-1909.

［6］龔金炎，吳曉琴，毛建衛，等.黃酮類化合物抗抑郁作用的研究進展［J］.中草藥，2011，42(1):195-199.

［7］楊 帆，劉艾林，杜冠華.黃酮類化合物對腫瘤多藥耐藥調節作用的研究進展［J］.中國新藥雜志，2010，19(2):109-113.

［8］Akinsulire O R，Aibinu I E，Adenipekun T，et al.In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum Pinnatum and Alanchoe Crenata［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2007，4(3):338-344.

［9］孫國強，趙豐麗，劉哲瑜，等.白骨壤葉黃酮提取及抗氧化活性研究［J］.中國釀造，2010(11):95-100.

［10］馬陶陶，張群林，李 俊，等.三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討［J］.時珍國醫國藥，2008，19(1):54-56.

［11］鐵 梅，趙素云，馬 勇，等.富硒蛹蟲草的抗氧化活性研究［J］.分析科學學報，2009，25(3):285-289.

［12］張 娜，楊保求，王 倩，等.棗核黃酮類物質的抗氧化性研究［J］.安徽農業科學，2010，38(35):20037-20039.

［13］周 萍，王麗萍，鄧 勵，等.西歸黃酮體外抗氧化活性的研究［J］.安徽農業科學，2011，39(3):1359-1360.

［14］慶偉霞，王 勇，姚素梅，等.三波長-分光光度法測定大葉落地生根中總黃酮的含量［J］.分析實驗室，2010，29(10):90-92.