人工牛黃中牛磺酸成分的含量測定

鐘勝佳，石巖，熊婧，魏鋒，肖新月，馬雙成，林瑞超

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.湖南省益陽市食品藥品檢驗所，湖南 益陽 413000)

人工牛黃中牛磺酸成分的含量測定

鐘勝佳2，石巖1*，熊婧1，魏鋒1，肖新月1，馬雙成1，林瑞超1

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.湖南省益陽市食品藥品檢驗所，湖南 益陽 413000)

目的建立人工牛黃中牛磺酸的含量測定方法。方法以異硫氰酸苯酯作為衍生化試劑衍生后進行HPLC分析，采用C18色譜柱，柱溫為43 ℃；醋酸鈉緩沖液-乙腈體系為流動相，流速1.0 mL·min-1；檢測波長為243 nm。結果牛磺酸在0.034～0.34 μg與峰面積呈良好線關系，r=0.999 9，平均回收率為102.19%，RSD=0.94%(n=6)。結論該方法結果準確、可靠，重現性好。

人工牛黃；牛磺酸；衍生化；高效液相色譜法；異硫氰酸苯酯

牛黃是牛科動物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥膽結石，系名貴中藥材，但其資源匱乏，目前市場流通多以人工牛黃以及體外培育牛黃等牛黃替代品為主[1-2]。人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，其配方較為復雜。其中的牛磺酸最早是由牛黃中分離得到的，具有抗疲勞、解熱鎮痛等作用，又名牛膽堿、氨基乙磺酸、2-氨基乙磺酸，是中藥及保健食品中的重要指標性成分，其測定方法有薄層色譜法、化學滴定法、柱前衍生化液相色譜法、氨基酸分析儀法和比色法等，現行《中國藥典》人工牛黃項僅收載了牛磺酸的薄層鑒別，缺少對其的含量測定方法[3-10]。由于牛磺酸最早是從牛黃中來，并且具有與牛黃相近的功效，所以對于人工牛黃中牛磺酸的質量控制僅僅停留在薄層鑒別上是遠遠不夠的。本文針對牛磺酸無紫外吸收的性質，建立了柱前衍生化法，用以測定人工牛黃中的牛磺酸含量，取得了較好的結果。

1 儀器與試藥

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2489紫外/可見檢測器，EMPOWER工作站。牛磺酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111616-201002)。

試劑：乙腈為色譜純，醋酸鈉、三乙胺、鹽酸、醋酸為分析純，異硫氰酸苯酯(PITC,購自Sigma公司，標示純度≥99.0%)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent EclipseC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為43 ℃。以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用醋酸調pH值至6.5)(7∶93)為流動相A，以乙腈-水(4∶1)為流動相B，進行梯度洗脫：0～12 min，0%→8%B；12～17 min，8%→100%B；17～18 min，100%B；18～30 min，100%→0%B；30～35 min，0%B。流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為243 nm；進樣量為5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取牛磺酸對照品約16 mg，加水溶解并定容至100 mL，搖勻，即得牛磺酸對照品儲備液。精密量取該儲備液5 mL置于25 mL 量瓶中，加入0.1 mol·L-1PITC溶液2.5 mL和1 mol·L-1三乙胺溶液2.5 mL，室溫放置60 min，加50%乙腈定容至刻度，搖勻，取10 mL，加正己烷10 mL，振搖，放置10 min，取下層溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取人工牛黃樣品粉末約40 mg置于25 mL量瓶中，加水20 mL，超聲15 min，再加水定容至刻度，搖勻。精密量取該溶液5 mL，按2.2.1項下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.2.3 空白溶液 精密量取水5 mL，按2.2.1項下方法自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，即得。

2.3 系統適應性實驗

分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各5 μL，按2.1項下色譜條件進行測定。結果牛磺酸色譜峰分離度良好，空白無干擾。理論塔板數按牛磺酸計為127 421，分離度大于1.5。HPLC圖見圖1。

A.空白 B.對照品 C.樣品 1.牛磺酸圖1 牛磺酸柱前衍生化HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察

精密稱取牛磺酸對照品約16 mg置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻。分別精密量取該溶液1,2,3，4，5，10 mL置于10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，再分別精密吸取上述對照品溶液5 mL，按2.2.1項下方法下自“置25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL”起操作，制成線性對照品溶液1～6。按2.1色譜條件，注入液相色譜儀，測得峰面積，分別以牛磺酸對照品的進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y=6 552 614X-8 043，r=0.999 9，牛磺酸進樣量在0.034～0.34 μg與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

取一份對照品溶液，按上述色譜條件重復進樣6次，測定峰面積，計算得牛磺酸的RSD=0.30%，結果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取1號樣品溶液，按上述色譜條件分別于0，3，7，10，17，24 h進樣，測定峰面積，計算得牛磺酸色譜峰的RSD=1.81%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取1號樣品6份，每份約40 mg，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定含量，計算得牛磺酸含量平均值為10.55%(n=6)，RSD=1.68%。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取1號樣品6份，每份約20 mg，精密加入牛磺酸對照品溶液(0.218 44 mg·mL-1)10 mL，按2.2.1項下方法操作，制備所需溶液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結果見表1。

表1 牛磺酸回收率試驗結果

注：牛磺酸對照品加入量均為2.184 4 mg

2.9 耐用性試驗

為了考察不同色譜柱對測定結果的影響，特選取3個不同廠家色譜柱對1號樣品進行測定，結果見表2。

結果表明用不同牌號色譜柱測得的供試品中牛磺酸含量相差不大，該方法對不同C18色譜柱耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

用上述方法對市售不同廠家的3批人工牛黃樣品進行了測定，結果見表3。

表3 3批人工牛黃樣品測定結果

3 討論

分別考察了超聲提取人工牛黃10，15，20 min的情況，發現超聲提取15 min已經達到提取的最大值，故選擇15 min為提取時間。

對衍生化后的牛磺酸對照品進行紫外掃描，發現243 nm為最大吸收波長，故選擇243 nm為檢測波長。

本文利用牛磺酸可與異硫氰酸苯酯結合成為穩定并且有較強紫外吸收的衍生化產物這一性質，研究建立了異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定人工牛黃中牛磺酸的方法，并經過相關方法學驗證，結果準確可靠，可以用作人工牛黃中牛磺酸指標的質量控制。

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[10] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：5-7.

DeterminationofTaurineinArtificialCow-bezoanbyHPLCwithPrecolumnPhenylisothiocyanateDerivatization

ZHONG Sheng-jia2，SHI Yan1，XIONG Jing1，WEI Feng1，XIAO Xin-yue1，MA Shuang-cheng1，LIN Rui-chao1

(1.NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050；2.YiyangInstituteforFoodandDrugControl,Yiyang413000,China)

Objective：To establish an HPLC method to determine the content of taurine in artificial cow-bezoan.MethodsAn HPLC system was equipped with a C18column.Phenyl iso-thiocyanate(PITC) was used for the pre-column derivatization of taurine.The mobile phase consisted of sodium acetate buffer solution-acetonitrile-water.Flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 243 nm.ResultsThe linear range was 0.034～0.34 μg(r=0.999 9).The recovery was 102.19%，RSD was 0.94%(n=6).ConclusionThe method is accurate and practical,the result is satisfied.

Artificial cow-bezoan；Taurine；Derivatization；HPLC；PITC

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石巖，Tel：(010)67095432，E-mail：san0373@yahoo.com.cn

2012-06-19)