麥冬及其混偽品的ITS2序列分析及鑒別研究

鄭司浩，孫稚穎，黃林芳*

(1.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室 中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

麥冬及其混偽品的ITS2序列分析及鑒別研究

鄭司浩1，孫稚穎2，黃林芳1*

(1.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室 中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

目的對麥冬及其易混偽品進行分子鑒別，以確保該藥材的質量和臨床安全用藥。方法從GenBank數據庫中下載麥冬及其混偽品的ITS2片段序列，利用MEGA等軟件進行相關數據分析，構建NJ樹，并預測麥冬及其混偽品的ITS2二級結構。結果麥冬與其3個混偽品的ITS2序列間存在明顯差異，基于ITS2序列的NJ樹及其二級結構亦能對麥冬及其混偽品進行鑒別。結論ITS2條形碼序列可有效地鑒別麥冬及其混偽品。

麥冬；混偽品；ITS2；分子鑒定；DNA條形碼

藥材麥冬(Ophiopogonis Radix),又名沿階草、書帶草、麥門冬，為百合科植物麥冬(Ophiopogon japonicus (L.f) Ker-Gawl.)的干燥塊根[1]。麥冬性甘、微苦，微寒，有養陰生津，潤肺清心之功效，用于肺燥干咳，陰虛癆嗽，喉痹咽痛，津傷口渴，內熱消渴，心煩失眠，腸燥便秘等癥。藥理作用研究表明，麥冬在降血糖、抗衰老、抗氧化及改善心腦血管疾病方面作用明顯[2]。由于各地用藥習慣不同，市場上出現許多麥冬的混偽品，主要有闊葉山麥冬(Liriopemuscari〔Decaisne〕 L.H.Bailey)、山麥冬(Liriopespicata〔Thunberg〕 Loureiro)、石刁柏(AsparagusofficinalisL.)等[3-4]。利用分子生物學技術進行藥用植物的鑒定和區別近年來成為國內外研究熱點，其中DNA條形碼鑒定技術倍受學術界關注[5-7]。DNA條形碼技術是一種新的生物鑒定方法，它應用短的、標準的DNA片段作為物種標記。在眾多條形碼中，ITS2片段具有更多優點，它在物種水平變異較快、序列片段較短，是最具有潛力的候選DNA條形碼之一[8-12]。本文以ITS2條形碼序列鑒定麥冬及其3種混偽品闊葉山麥冬、山麥冬和石刁柏，以期建立一種快速、有效、準確的分子鑒定方法，確保其藥材的質量及用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料來源

所用ITS2序列從GenBank下載，詳情見表1。

表1 材料來源

1.2 數據分析

運用MEGA等軟件分析研究樣本的ITS2序列，計算種內種間遺傳距離(K-2P距離)等，并建立NJ樹進行物種鑒定。利用Schultz等[13]建立的ITS2數據庫及其網站預測ITS2二級結構。

2 結果與分析

2.1 麥冬種內序列變異及分析

麥冬8條種內參考序列比對后長度為219 bp，種內序列變異位點有6處，如圖1所示。麥冬種內ITS2序列的平均K-2P距離為0.009 0，最大K-2P距離為0.018 5。

2.2 麥冬種間序列變異及分析

麥冬與其混偽品的序列種間變異位點較多，見圖2。麥冬及其混偽品ITS2序列種間K-2P距離的平均值為0.183 3，最小K-2P距離為0.084 6。

2.3 麥冬及其混偽品ITS2序列NJ樹構建及分析

利用系統聚類的方法，基于ITS2序列構建NJ樹(見圖3)。從樹圖可以看出，正品麥冬與麥冬屬其他混偽品闊葉山麥冬、山麥冬以及天門冬屬的石刁柏可以有效鑒別開。

圖3 基于ITS2序列構建的麥冬與其混偽品的鄰接(NJ)樹

2.4 麥冬及其混偽品ITS2序列二級結構及分析

利用Schultz等[11]建立的ITS2數據庫及其網站預測了麥冬及其混偽品的ITS2二級結構，如圖4所示，通過比較麥冬與其混偽品ITS2序列二級結構可以看出，麥冬與闊葉山麥冬的ITS2序列二級結構在螺旋II和IV區保守，在螺旋I和III區有差異；麥冬與山麥冬在螺旋II區保守，在螺旋I、III和IV區均有差異；麥冬與偽品石刁柏在四個螺旋區均有明顯差異。因此，基于ITS2序列預測的二級結構的比較也可以有效的鑒別麥冬及其混偽品。

圖4 麥冬與其混偽品ITS2二級結構比較

3 討論

麥冬為我國常用中藥材，應用廣泛，具有重要的藥用價值。然而其地方習用品和混偽品市場上較多，導致該藥材在流通和使用中出現混亂。傳統鑒別麥冬的方法有性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒定及薄層色譜等[14-18]，但是存在一定的局限性，主要表現在單一的傳統鑒定方法不能準確的鑒別麥冬及其混偽品，需多種方法綜合分析，只能為鑒定提供參考依據。DNA條形碼技術具有技術成熟、操作簡便、迅速、可靠、適合廣泛推廣等優點，是一種新的分子生物鑒定技術。

本文應用DNA條形碼技術測定了麥冬及其混偽品的ITS2序列并預測了它們的ITS2二級結構，研究結果表明，麥冬及其混偽品的ITS2序列變異明顯，種內最大遺傳距離(K-2P距離,0.018 5)小于種間最小遺傳距離(0.084 6)；基于ITS2序列建立的NJ樹可以很明顯的把不同來源的麥冬及其混偽品鑒別開來；此外，通過ITS2序列預測的二級結構同樣可以從直觀上更好的鑒別麥冬及其混偽品。總之，基于ITS2序列的DNA條形碼技術可以簡便、準確地鑒定麥冬及其混偽品，對保障該藥材使用的安全性和有效性具有重要的意義。

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AnalysisandIdentificationofOphiopogonjaponicusandItsAdulterantsUsingITS2Sequences

ZHENG Si-hao1,SUN Zhi-ying2,HUANG Lin-fang1

(1.TheKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine,MinistryofEducationInstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193China;2.CollegeofChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

Objective: To analysis the DNA barcodes ofOphiopogonisRadixand its adulterants,and to ensure the quality and clinical safety of drugs.MethodsDownload the ITS2 sequences ofOphiopogonisRadixand its adulterants from GenBank database,and the genetic distances were computed using MEGA 4.0 in accordance with the Kimura 2-Parameter (K2P) model,and the phylogenetic tree was constructed.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website founded by Schultz et al.ResultsOphiopogonisRadixand its adulterants can be identified by the differences of the ITS2 sequences.The phylogenetic tree and the ITS2 secondary structure can also distinguish betweenOphiopogonisRadixand its adulterants.ConclusionITS2 barcode sequences can serve as a valuable marker to identifyingOphiopogonisRadixand its adulterants,and it has a broad application prospects in the field of Traditional Chinese Medicine.

Ophiopogonjaponicus;Adulterants;ITS2;Molecular identification;DNA barcoding

*黃林芳,Tel： (010)57833197,E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

2011-11-23)