鎖陽中粗多酚和粗多糖抗氧化活性的比較△

段園園，馬耀，陳貴林

(內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021)

中藥科技

鎖陽中粗多酚和粗多糖抗氧化活性的比較△

段園園，馬耀，陳貴林*

(內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021)

目的比較鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性，為鎖陽入藥提供依據。方法100 g鎖陽粉末提取粗多酚和粗多糖。采用超聲波輔助乙醇法提取粗多酚，依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇進行萃取。同時用水提醇沉法提取粗多糖。用DPPH·法和ABTS+法進行鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性檢測。結果多酚粗提物中的總酚含量達到了922.9 mgGAE·g-1(沒食子酸當量)，而多糖粗提物中的多糖含量為366.6 mg·g-1(葡萄糖當量)。DPPH·法檢測鎖陽粗多酚和粗多糖的IC50值分別為79.3 μg·mL-1和145.6 μg·mL-1。經ABTS+法檢測，二者的TEAC值分別為2.12 mmol·g-1和0.69 mmol·g-1。結論鎖陽粗多酚的抗氧化活性遠高于鎖陽粗多糖。

鎖陽；多酚；多糖；DPPH·；ABTS+

自由基是一類具有不配對電子的活潑化學基團，人體內會不斷產生自由基如超氧陰離子、過氧化氫、羥基離子等。但隨著年齡的增長，人體清除這些自由基的能力在下降。目前認為,人類疾病如各種炎癥、動脈粥樣硬化、早老性癡呆、帕金森氏病、急性腦血管病、癌癥、衰老等,均與自由基的氧化刺激密切相關[1]，而傳統的合成抗氧化劑又會有很多不良反應。因此,開發天然無害的抗氧化劑迫在眉睫。

鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.是一種重要的荒漠寄生植物，藥食兼用，為內蒙古道地藥材。鎖陽性甘、溫，具有補腎陽，益精血，潤腸通便的功能[2]。鎖陽富含多酚類及多糖類物質，二者兼有清除體內自由基、抗脂質氧化、抗衰老、預防心血管疾病、防癌、防輻射等生物活性，所以鎖陽又稱為“不老藥”[2-3]。

目前，對鎖陽的有關報道中，以多糖類物質為主,如多糖提取工藝的研究[4]，多糖對染色體端粒長度的影響[5]等，而抗氧化活性檢測方面較少。對于富含的多酚類物質，只有鞣質[6]在含量方面有所報道，其他鎖陽多酚類物質報道的很少。本實驗采用DPPH·法和ABTS+法對鎖陽多酚和多糖進行抗氧化測定并比較，以求找出鎖陽中的主要抗氧化成分，為把鎖陽開發為新型天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

選用的鎖陽采自內蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨貴特拉鎮，經內蒙古大學生命科學學院生物系陳貴林教授鑒定，肉質莖自然干燥、粉碎，過30目篩，干燥后備用。

1.2 儀器

KUDOS SK7210LHC超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司),UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津有限公司),AP-01真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司),BT2202S sartorious電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司),Xllegra X-15R離心機(美國貝克曼庫爾有限公司),RE-5298旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)。

1.3 試劑

沒食子酸、碳酸鈉、無水乙醇，葡萄糖、苯酚，濃硫酸,國產分析純試劑；福林酚試劑、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS+[2,2-聯氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]、及Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)和維生素E購自Sigma公司；抗壞血酸(天津光復精細化工研究所)。

2 方法

2.1 標準曲線的制作

2.1.1 多酚標準曲線的制作 采用福林酚法[7]，分別取不同濃度的標樣沒食子酸溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，加入福林試劑1.0 mL，充分振蕩后靜置3～4 min，分別加入10 %碳酸鈉溶液1.0 mL，搖勻置于25 ℃恒溫水浴中反應2 h，于765 nm下測定吸光度，沒食子酸標準曲線以吸光值A和沒食子酸含量M作回歸方程，見圖1。

圖1 多酚標準曲線

2.1.2 多糖標準曲線的制作 采用苯酚硫酸法[8]，分別取不同濃度的標樣葡萄糖溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，再各加入5 %苯酚試劑1.0 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 mL搖勻，蓋上試管塞靜置25 min后以蒸餾水為空白對照，于490 nm下測定吸光度，葡萄糖標準曲線以吸光值A和葡萄糖含量C作回歸方程，見圖2。

圖2 多糖標準曲線

2.2 粗多酚及粗多糖的提取

2.2.1 粗多酚的提取 采用超聲波輔助乙醇法，取鎖陽粉末100 g以1∶15的料液比與60 %乙醇溶液混合，室溫下，在功率為350 W超聲波的輔助下進行提取，提取時間8 min，抽濾。乙醇提取液用旋轉蒸發儀將乙醇相旋蒸。剩余水相依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，每次3 h，將醋酸乙酯相和正丁醇相真空旋轉蒸發。然后用甲醇將兩相旋蒸的剩余部分合并，置于通風廚中直至樣品干燥，然后將所得固體研磨成粉末得到4.09 g，放于干燥陰涼處備用。

2.2.2 粗多糖的提取 采用水提醇沉法，取鎖陽粉末100 g，加入95 %的乙醇按1∶12的料液比進行浸提，浸提12 h后，除去上清液，濾渣自然干燥。將干燥后的濾渣用蒸餾水以1∶12的料液比在97 ℃下回流提取3 h，分別收集上清液和濾渣備用。將收集到的濾渣按上述方法再次回流提取，合并兩次提取液。將提取液減壓濃縮至總體積約120 mL，然后加入95 %乙醇至乙醇濃度達80 %后進行醇沉，12 h后收集沉淀，沉淀即為粗提多糖，待沉淀自然干燥后將其研磨成粉末得到8.05 g，放于干燥陰涼處備用。

2.3 粗多酚和粗多糖的含量測定

同標準曲線的制作相同，多酚含量以mg沒食子酸/g粗提多酚表示，為(922.9±25.2)mgGAE·g-1。多糖含量以mg葡萄糖/g粗提多糖表示為(366.6±15.9)mg·g-1。粗多酚含量為粗多糖的2.5倍。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH·法測定粗多酚和粗多糖 參照Golluecke A P B等[9]的方法，取2 mL不同濃度的樣品液(每個濃度重復3次)進行測定。按照下列公式計算清除率：

清除率%=[A1-(A-B)]/A1×100 %

式中,A為2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品液的吸光度；B為2 mL樣品液+2 mL乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH·溶液+2 mL乙醇的吸光度。

將鎖陽粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與維生素C、維生素E清除自由基的能力IC50值相比較，即清除一半自由基時所需的樣品濃度，確定其相對抗氧化活性。

2.4.2 ABTS+法檢測鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性 參照Roberta Re等[10]的方法測定，取30 μL不同濃度的樣品液(每個濃度重復3次)進行測定，將鎖陽粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與標準物質Trolox清除自由基的能力相比較，轉化成TEAC值，即達到一定濃度測試物質相當的抗氧化能力所需要的Trolox的濃度，確定其相對抗氧化活性。Trolox標準曲線的線性回歸方程為Y=4.553X+0.818，r=0.997。

3 結果

3.1 DPPH·法測定鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性

DPPH·法測定鎖陽粗多酚和粗多糖抗氧化活性是通過DPPH·的清除率來表示的，即IC50值越小，表明抗氧化活性越大。鎖陽粗多酚IC50值為79.3 μg·mL-1，粗多糖IC50值為145.6 μg·mL-1。粗多酚的IC50為粗多糖的54 %，即粗多酚抗氧化活性為粗多糖的1.8倍，見圖3。

圖3 鎖陽粗多酚和粗多糖IC50值的比較(n=3)

3.2 ABTS+法檢測鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性

TEAC值表示為達到一定質量濃度測試物質相當的抗氧化能力所需要Trolox的濃度，TEAC值越大，表明抗氧化活性越大。對于ABTS+自由基的清除能力，將各樣品清除ABTS+的能力按Trolox標準曲線轉化成TEAC值，鎖陽粗多酚TEAC值為2.12 mmol·g-1，粗多糖TEAC值為0.69 mmol·g-1。粗多酚的TEAC值為粗多糖的3.1倍，見圖4。

圖4 鎖陽粗多酚和粗多糖TEAC值的比較(n=3)

4 討論

本實驗中鎖陽粗多酚含量為粗多糖含量的2.5倍。100 g鎖陽粉末中沒食子酸當量為葡萄糖當量的1.3倍。DPPH·法和ABTS+法測定鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性基本一致，DPPH·法檢測粗多酚抗氧化能力為粗多糖的2倍，ABTS+法檢測粗多酚抗氧化能力為粗多糖的3.1倍，結果表明鎖陽粗多酚的抗氧化活性遠高于粗多糖。因此，多酚可視為是鎖陽的主要抗氧化成分之一。雖然鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性不如維生素C和維生素E,但鎖陽中除了多酚和多糖外還有其他的抗氧化成分，如花青素類，三萜類等。鎖陽作為整體入藥，其所有的抗氧化成分的抗氧化活性相加后要優于單一成份的抗氧化劑維生素C和維生素E。一般認為水果中起抗氧化作用的成分主要是維生素C，但有研究通過對比了15種水果及33種蔬菜的抗氧化活性與維生素C含量的關系，表明其抗氧化活性與維生素C含量無明顯的相關關系[11]。而且鎖陽作為中藥入藥，其功能不止抗氧化一種，其他功能如補腎、助陽、益精、潤腸等維生素C和維生素E卻未必有。最近的研究表明，鎖陽多糖可以通過抑制D-半乳糖衰老小鼠血細胞和腦細胞染色體末端端粒長度的縮短,從而延緩組織細胞的衰老進程[5]。鎖陽粗多酚及粗多糖的抗氧化活性比一些中藥類如黃連(249.856 μg·mL-1)[12]、地榆(260 μg·mL-1)[13]以及苦丁茶(265.3 μg·mL-1)[14]的抗氧化活性要強。因此，鎖陽多酚和多糖作為新型天然抗氧化劑的原料，再加上鎖陽抗衰老、抗癌、抗脂質氧化等功能，將為本身是藥食兼用的鎖陽提供更為廣闊的應用前景。

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ComparationofAntioxidantActivityofCrudePolyphenolandPolysaccharideinCynomoriumsongaricum

DUAN Yuan-yuan，MA Yao，CHEN Gui-lin

(CollegeofLifeScience,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China)

Objective: Provide scientific basis forC.songaricumbeing a medicine by comparing antioxidant activity of polyphenol and polysaccharide ofCynomoriumsongaricum.MethodsWe extract crude polyphenols and polysaccharides from 100 gCynomoriumpowder and use ultrasonic-assisted method to extract crude polyphenols and then use petroleum ether,chloroform,ethyl acetate and n-butanol to extract pure polyphenols.At the same time,we extract crude polysaccharides with water extraction and alcohol precipitation method.Detect crude polyphenol and polysaccharide’antioxidant activity with DPPH· and ABTS+method.ResultsTotal phenolic content of crude polyphenol reach 922.9 mg·g-1(gallic acid equivalent),However,the total polysaccharide content of crude polysaccharide is 366.6 mg·g-1(glucose equivalent).Crude polyphenol and polysaccharide’ IC50values of DPPH· were 79.3 μg·mL-1and 145.6 μg·mL-1and TEAC values of ABTS+method were 2.12 mmol·g-1and 0.69 mmol·g-1.ConclusionThe result show that the antioxidant activity of crude polyphenol is far higher than crude polysaccharide.

Cynomoriumsongaricum;Polyphenols;Polysaccharides;DPPH;ABTS+

國家科技支撐計劃項目(2011BAI07B07)，內蒙古科技創新引導獎勵資金項目(2010年度)

*陳貴林，E-mail:guilinchen@yahoo.com.cn

2011-09-13)