SIVmac239感染恒河猴急性期回腸派氏淋巴結(jié)中淋巴細胞亞群的變化

劉克劍，叢喆，吳芳新，王衛(wèi)，熊競，魏強，秦川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

SIVmac239感染恒河猴急性期回腸派氏淋巴結(jié)中淋巴細胞亞群的變化

劉克劍，叢喆，吳芳新，王衛(wèi)，熊競，魏強，秦川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

目的分析SIVmac239感染早期中國恒河猴回腸派氏淋巴結(jié)淋巴細胞數(shù)量及亞群的變化，探討這些變化與疾病進展的可能關系。方法以靜脈注射SIVmac239制備恒河猴AIDS模型，對回腸派氏淋巴結(jié)進行CD4和CD8免疫組化標記，分離Peyer’s集合淋巴結(jié)淋巴細胞，分別標記CD3、CD4、CD8、CD28、CD95單克隆抗體，以流式細胞儀檢測T細胞及其亞群的表達情況。結(jié)果SIVmac239感染急性期中國恒河猴Peyer淋巴結(jié)中CD4+/CD8 +比值持續(xù)下降，記憶性細胞比例升高，但Peyer淋巴結(jié)形態(tài)及CD4+T細胞數(shù)量未見明顯變化，CD8+T細胞從第5天開始持續(xù)升高。結(jié)論SIVmac239感染急性期，中國恒河猴回腸派氏淋巴結(jié)形態(tài)及CD4+T細胞數(shù)量基本維持，向記憶性細胞的轉(zhuǎn)化增加，但是CD4+/CD8+比值下降。

AIDS;派氏淋巴結(jié);T淋巴細胞;恒河猴

在我們長期進行的靈長類艾滋病動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，不同動物疾病進程表現(xiàn)不十分一致，除了個體遺傳差異等因素影響，也可能與病毒早期和機體相互作用相關，因此，了解腸道粘膜組織在AIDS發(fā)病過程中的重要作用對疾病的發(fā)生、發(fā)展至關重要。

腸道粘膜組織的免疫系統(tǒng)主要由兩部分構成，分別是免疫誘導部位，主要是有結(jié)構的淋巴組織，如派氏淋巴結(jié)(peyer’s patch，PP)和免疫效應部位，主要是分布在粘膜固有層中彌散的淋巴組織。目前AIDS研究中關于粘膜部分主要集中在固有層，而派氏淋巴結(jié)的資料相對較少，缺乏系統(tǒng)性研究。據(jù)文獻推測艾滋病病毒的宿主侵入、早期控制、疾病轉(zhuǎn)歸等與PP直接相關?；诖?，本文對SIVmac239感染早期的中國恒河猴回腸腸道PP中免疫細胞數(shù)量及分群的變化做初步研究，分析可能的對疾病進程的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與模型制備

健康恒河猴9只，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(合格證編號:SCXK(京)2005－2005)，實驗前體重為3～5 kg，動物實驗在本所P3實驗室進行［SYXK(京)2009－0003］;實驗動物經(jīng)IFA法檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV－1)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV－1)的感染。其中猴489、3－2、3－3、3－4、3－5靜脈感染1000 TCID501mL SIVmac239，其余4只作為正常對照，定期采樣，測定血漿病毒載量及細胞變化。

1.2 樣品采集

1．2．1 外周血分別于感染前及感染后第0，7，14，28天采集實驗猴EDTA抗凝血，測定血漿病毒載量、血常規(guī)及流式檢測［1］。

1．2．2 腸道組織采集及病理制片分別于第0，1，3，5，7，14天剖腹手術截取10 cm回腸腸段(0 d取4只動物，其余時間點一只)，分離PP淋巴細胞，其余經(jīng)4%中性甲醛固定24 h，修塊，4%福爾馬林再固定24 h，包埋、切片。

1．2．3 PP淋巴細胞分離腸段縱向剖開，解剖鏡下用眼科剪剪下派氏淋巴結(jié)［2］，置于預冷的含5%胎牛血清的PRMI－1640(R－5)培養(yǎng)基中。剪碎，用冷的PBS(不含鈣鎂離子)沖洗兩次。研磨，70 μm孔徑細胞篩過濾(BD，Cat#352350)。4℃2000 rpm離心10 min，重懸，調(diào)整細胞濃度為1×106cell/mL。

1.3 免疫組化

組織切片用抗CD4、CD8抗體進行標記。具體步驟如下:PBS沖洗，2 min×3次。滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次。滴加試劑1(中杉金橋，PV－9000)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min ×3次。滴加試劑2(中杉金橋，PV－9000)，37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。DAB溶液顯色。自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片，鏡下觀察，計數(shù)(每個樣本取3個高倍視野，計算平均值)。

1.4 流式檢測

取細胞懸液100 μL，置于流式管中，標記抗CD3、CD4、CD8、CD28，CD95抗體，室溫避光作用15 min。用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，懸浮于500 μL的pH7．2 PBS中，BD FACA－CANTO FACS儀上分類計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SIVmac239感染猴血漿病毒載量結(jié)果

血漿病毒載量結(jié)果顯示，全部攻毒的動物在攻毒后第7天可檢測出血漿病毒載量，載量峰值位于1×105到1×107copies/mL之間，表明這些動物在實驗進行中的28 d內(nèi)被病毒感染并且病毒能進行有效復制。

圖1 SIVmac239感染猴血漿病毒載量結(jié)果Fig．1The changes of viral loads in plasma of SIVmac239－inoculated rhesus monkeys

2.2 SIVmac239感染猴腸道PP淋巴結(jié)CD4+T淋巴細胞免疫組化結(jié)果

0 d結(jié)果顯示，健康中國恒河猴派氏淋巴結(jié)濾泡中心發(fā)育完好，CD4+細胞主要分布于淋巴鞘，在濾泡中心也有零星分布，大小正常，形態(tài)完整;感染猴在SIVmac239感染后1，3，5 d派氏淋巴結(jié)與正常恒河猴派氏淋巴結(jié)一樣T細胞分布于淋巴鞘，形態(tài)完整，CD4+T淋巴細胞在局部細胞密度與正常對照組未見明顯區(qū)別(彩插5圖2 A，C)。7，14 d派氏淋巴結(jié)中心區(qū)域淋巴細胞有所增加，CD4+T淋巴細胞在局部細胞密度有所增大(彩插5圖2 A，C)。CD8+細胞主要分布于淋巴鞘，在濾泡中心也有零星分布，大小正常，形態(tài)完整;數(shù)目隨時間增加而增多(彩插5圖2 D)。

2.3 SIVmac239感染猴腸道PP淋巴結(jié)CD4+/ CD8+T細胞比值的變化

在SIVmac239感染后，免疫組化計數(shù)結(jié)果:動物的PP CD4+/CD8+T細胞比值減少。由感染前的0．90左右降到感染后5 d的0．55，第7天為的0．39，第14天為0．37(彩插5圖2 A)。流式細胞檢測結(jié)果:動物的PP CD4+/CD8+T細胞比值減少。由感染前的1．00左右降到感染后5 d的0．25，僅為正常值的25%，第7天為正常值的40%，第14天僅為正常值的3%(彩插5圖2 B)。

2.4 SIVmac239感染猴回腸派氏淋巴結(jié)中記憶性T細胞的變化

恒河猴感染SIVmac239早期PP淋巴結(jié)中Naive CD4+T細胞所占的比例隨著時間有所增加，從正常的27%升至第14天的85．5%。同時伴隨著TCM的持續(xù)下降，從正常恒河猴的71．5%下降至第5天的53．1%，第14天時更是降至9．5%。

圖3 SIVmac239感染后急性期不同天數(shù)回腸內(nèi)PP CD4+/CD+8比值

圖4 SIVmac239感染急性期恒河猴回腸PP，CD4+/CD8+T Na?ve與記憶性CD4+/CD8+T比例的變化Fig．4The changes of Na?ve，Tcm，Tem，CD4+/CD8+T cells in PP of Chinese－origin rhesus monkeys infected intravenously with SIVmac239

與此相反，正常猴回腸PP淋巴結(jié)中TEM僅占1%左右，感染后略有增加，在5 d、7 d達到峰值，約為30%到40%，到第14天時則重新下降至2．3%。

Naive CD8+T比例第3天下降至正常值(22．2%)的一半左右，之后持續(xù)下降，一致維持至14 d均無明顯變化;TcM與Naive情況相似，感染后3 d即從正常的27．3%降到2．0%，持續(xù)到14 d; TEMCD8+T細胞在7 d內(nèi)比例逐漸升高(43%－97%)，到14 d一直維持在較高水平。

3 討論

消化道是HIV及其相關病毒的侵犯目標，HIV在消化道粘膜中攻擊目標主要是CD4+T淋巴細胞，在整個感染過程中起著重要作用，與外周血液相比，一般認為在感染過程中，粘膜CD4+T淋巴細胞的損耗出現(xiàn)得更早、更劇烈，腸道中最豐富的CD4 +T淋巴細胞存在于腸道固有層并且多處于激活狀態(tài)，所以感染及消耗的細胞也主要在固有層。固有層之外，腸道內(nèi)的效應部位，PP由于其結(jié)構與功能均與固有層有所不同，所以派氏淋巴結(jié)內(nèi)的CD4 +T細胞在感染初期的表型與形態(tài)與固有層也是否有所區(qū)別，為本文關注內(nèi)容之一。

PP是沿小腸縱向分布，位于粘膜下層，肉眼可見的微小的集合淋巴組織［3］。在一般情況下，PP集中于小腸末端部分(特別是回腸)，PP由上皮下圓頂區(qū)、濾泡區(qū)和濾泡旁區(qū)組成。T細胞位于濾泡旁區(qū)，主要為CD4+T和CD8+T細胞，表達T細胞受體，其中有中心記憶性和初始T淋巴細胞［4，5］。

在免疫反應中，首先，初始T細胞進入PP，成為記憶/效應性T細胞后，從PP粘膜通過傳出淋巴結(jié)和外周血移植向效應部位［6］。HIV優(yōu)先感染激活的CD4+T細胞，根據(jù)效應部位與誘導部位的差異，在感染早期，粘膜CD4+T細胞的嚴重損耗，但本文對感染早期PP的免疫組化及流式檢測表明，PP中CD4+T細胞的減少及破壞在SIVmac239感染的14 d內(nèi)程度是很輕微的，如圖2所示。雖然流式結(jié)果顯示在感染早期PP CD4+/CD8+T淋巴細胞比值有所下降，這提示了在CD4+數(shù)目沒有明顯降低的情況下，CD8+T細胞的數(shù)目增多，針對PP CD8+細胞的免疫組化結(jié)果支持這一推斷，如圖3。所以CD4+T細胞的穩(wěn)定與CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的下降不矛盾。某些研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染晚期在派氏淋巴結(jié)中有與其他淋巴組織類似的T細胞變化，主要是CD4+T細胞數(shù)目的減少。結(jié)合感染初期PP中CD4+T淋巴細胞相對完好的狀況，如果能有效減緩PP中CD4+T細胞的損耗將有助于延緩AIDS的進程。

HIV－1感染后的T細胞免疫應答在感染早期，至少在感染之后的10 d內(nèi)，機體外周血中檢測不到明顯的T細胞應答，病毒在這段時間內(nèi)大量擴增，在不同的靶細胞中潛伏，為病毒的長期持續(xù)性感染奠定了基礎。感染10 d后(2～3周)，隨著病毒的進一步擴增，產(chǎn)生大量的T細胞免疫反應，病毒載量隨著CD8+T細胞免疫反應的出現(xiàn)與升高開始下降，并逐步到達一個穩(wěn)定點(set point)。與此相似，來自恒河猴外周血的數(shù)據(jù)也表明，針對SIV的外周血特異性T細胞應答主要發(fā)生于感染14天以后［7］。但在SIVmac239感染早期的恒河猴回腸PP中，7 d之內(nèi)既能檢測到活躍的細胞免疫應答，表現(xiàn)為效應記憶性CD4+T和CD8+T淋巴細胞比例的逐步升高，說明在感染很早期病毒復制活躍的部分(比如腸道粘膜)已經(jīng)有活躍的免疫應答，血液中檢測結(jié)果的延遲說明血液可能并不是了解病毒感染早期機體生物事件的有效窗口。目前有關于粘膜的研究，比如對粘膜固有層的研究表明，固有層含有各種表型的T細胞，包括大量的CD4+T細胞，在正常的人類及非人靈長類當中，固有層CD4+ T細胞與CD8+T細胞的比率與外周血及淋巴結(jié)相似，但粘膜中表達CCR5的CD4+T細胞比例更大，擁有記憶表型并表達細胞激活的標志物，并且大部分CD4+T細胞也在原位產(chǎn)生細胞因子，提示這些細胞是激活的并最終分化的細胞，也是HIV/SIV感染的極好靶標。所以在固有層，感染3～4 d后即可檢出大量的受感染細胞，并且SIV感染猴的粘膜效應位點CD4+T細胞劇烈而迅速的損耗［3］。作為目前研究AIDS最實用的模型，SIV感染恒河猴腸道組織中早期T細胞免疫反應的變化為研究HIV感染者疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供了線索。

而同樣作為粘膜免疫系統(tǒng)的構成部分，免疫誘導部位的PP，其CD4+T細胞數(shù)目變化與固有層相比卻在急性期未見明顯變化。而在免疫表型方面，由于HIV－1可優(yōu)先感染HIV－1特異性CD4+T細胞，隨著病情的進展，HIV－1特異性CD4+T細胞會逐漸減少乃至完全耗竭。HIV－1特異性CD4+T細胞的主要功能在于維護HIV－1特異性CD8+T細胞的功能上，而不是在直接抗擊HIV－1中。既往的研究也表明，CD4+T細胞在CD8+T細胞免疫反應的激活，記憶性CD8+T細胞的維持以及CD8 +T細胞的功能成熟等過程中起重要的作用。相應地，HIV－1感染所導致CD4+T細胞的耗竭，可導致HIV特異性的記憶CD8+T細胞的成熟障礙以及HIV－1特異性CD8+T細胞的功能受損［8－9］。如圖3所示，效應記憶性CD8+T細胞在感染14d后在PP中比例的下降與效應記憶性CD4+T細胞的下降趨勢相同，且效應記憶性CD4+T細胞下降比例更為明顯，從側(cè)面證明，在感染早期的PP效應記憶性CD4+T細胞的丟失可能是導致效應記憶性CD8+T細胞比例下降的原因。

綜上所述，關于SIV感染急性期不同時間PP淋巴細胞的變化，目前尚未見相關報道。本研究中正常對照組中國恒河猴PP中CD4/CD8細胞約等于1。與正常對照組相比，SIVmac239感染的中國恒河猴PP中CD4/CD8+T細胞比值顯著降低，但同時PP中CD4+T細胞的數(shù)量及形態(tài)幾乎沒有變化，而同時期其它研究表明固有層中的CD4+數(shù)量急劇下降且大量凋亡及壞死，說明在感染急性期PP中的CD4+可能得到循環(huán)血中T細胞的補充，從而維持其形態(tài)及功能。因此PP中CD4+T細胞數(shù)量和功能在感染早期對維持粘膜局部的免疫功能發(fā)揮影響。SIVmac239感染急性期PP中CD4+T細胞數(shù)量及形態(tài)的維持，以及向記憶性表型的轉(zhuǎn)化提示，PP在感染早期對補充因感染損失的淋巴細胞起重要作用，同時，對病毒及機體相互作用后最終造成不同感染程度可能產(chǎn)生一定影響。

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The Changes of Lymphocytes from Ileum Peyers Pacth from Rhesus Monkeys at the Earliest Period with SIVmac239 Infection

LIU Ke－jian，CONG Zhe，WU Fang－xin，WANG Wei，XIONG Jing，WEI Qiang，QIN Chuan
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese medicine，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo analyze the changes of lymphocytes from ileum Peyers pacth from Chinese rhesus monkeys at acute period with SIVmac239 infection．Methods9 rhesus monkeys were used and 5 were infected with SIVmac239 via intravenous injection．The tissues or lymphocytes from ileum Peyers pacth lymph nodes from rhesus monkeys at acute period were collected and analyszed with CD4+，CD8 immunohistochemistry and flow cytometry T－cell subsets labeling with CD3，CD4，CD8，CD28，CD95 monoclonal antibodies respectively．ResultsObviously declined CD4+/CD8+ratio and increased memory cells(CD4+＆CD8+)ratio and CD8+T cells were detected in Peyers lymph nodes，but CD4 counts had no significant change in Peyers lymph nodes．ConclusionDeclined CD4+/CD8+ ratio and increased memory cells(CD4+＆CD8+)ratio were found in Peyers lymph nodes from rhesus macaques at acute period with SIVmac239 infection，however，the meaning and possible affection to disease need further study．

AIDS;Peyer’s Patch;T cell;Reshus monkeys

R373．33R332

A

1671－7856(2012)06－0025－05

10．3969/j．issn．1671－7856．2012．06．007

2010－08－20

“十二五”國家科技重大專項課題(2012ZX10004－501);協(xié)和青年基金(SIV感染早期粘膜屏障結(jié)構的改變)。

劉克劍，男，博士生，從事實驗動物病毒學研究工作。

秦川，教授，博士生導師，研究方向:重大傳染病發(fā)病機制。E－mail:qinchuan@pumc．edu．cn。

魏強，教授，博士生導師，研究方向:艾滋病模型及應用。E－mail:weiqiang@cnilas．pumc．edu．cn。