亞麻籽木酚素預防乳腺癌及與雌激素的關系

劉珊，王小兵，李愛東，劉朝陽，田海梅，李茉，趙文雅，李艷芬，劉靜，宋培培，張偉

(1.北京協和醫學院，中國醫學科學院，腫瘤醫院，生物檢測中心，北京100021; 2.北京協和醫學院，中國醫學科學院，腫瘤醫院，中心實驗室，北京100021)

亞麻籽木酚素預防乳腺癌及與雌激素的關系

劉珊1，王小兵1，李愛東2，劉朝陽1，田海梅1，李茉1，趙文雅1，李艷芬1，劉靜1，宋培培1，張偉1

(1.北京協和醫學院，中國醫學科學院，腫瘤醫院，生物檢測中心，北京100021; 2.北京協和醫學院，中國醫學科學院，腫瘤醫院，中心實驗室，北京100021)

目的通過卵巢切除術建立雌性大鼠去勢模型，探究亞麻籽粉木酚素預防乳腺癌的功能及與雌性激素的關系。方法將48只雌性Wistar大鼠隨機分為基礎飼料組(BD)、基礎飼料去勢組(BDC)、亞麻籽粉組(FS)和亞麻籽粉去勢組(FSC)，每組12只，對全部大鼠進行二甲基苯蒽(DMBA)一次性灌胃(2mg/kg體重)建立誘發的乳腺癌實驗動物模型;一周后對BDC組、FSC組大鼠行去勢手術，連續觀察21周，測定瘤體的體積和重量，并取乳腺組織進行病理學檢查。結果實驗期間動物一般狀況良好，實驗組大鼠未出現明顯毒副作用;亞麻籽粉組(FS和FSC組)大鼠發生可觸及腫瘤的時間較相應對照組晚2到4周;亞麻籽粉組大鼠單純性增生和不典型增生以及乳腺癌發生率和病灶數均顯著低于相應對照組(單純性增生:FS vs BD，P=0.006＊＊;FSC vs BDC，P＜0.001＊＊;不典型增生:FS vs BD，P=0.048*;FSC vs BDC，P=0.014*;乳腺癌:FS vs BD，P=0.028*;FSC vs BDC，P＜0.047*);亞麻籽粉組大鼠腫瘤體積和重量均小于基礎飼料組;FS和FSC組研究結果提示亞麻籽粉木酚素抑制增生發生及腫瘤細胞的生長的能力與實驗動物體內雌性激素水平有關(單純性增生:P=0.008＊＊;不典型增生:P=0.042*;乳腺癌:P=0.033*)。結論亞麻籽粉木酚素可有效預防和降低化學誘癌劑DMBA所誘發的乳腺癌、癌前病變和單純性增生的發生，預防乳腺癌的功能和效果受到體內雌性激素影響。本研究結果對未來實施木酚素預防乳腺癌及有效人群的篩選具有參考價值。

木酚素;亞麻籽粉;大鼠;乳腺癌

回顧性流行病學研究發現婦女服用亞麻籽木酚素可顯著降低乳腺癌的發生風險，進一步發現絕經前婦女服用木酚素較絕經后婦女服用木酚素更能顯著的降低乳腺癌的初發和復發風險，因此推測木酚素在絕經前、后婦女的預防乳腺癌功能的差異可能與婦女體內雌性激素分泌及代謝水平有關［1，2］，但目前尚缺乏直接實驗證據支持上述觀點。

本研究將首次通過實驗動物模型研究并報道亞麻籽木酚素預防乳腺癌的功能效果及與雌激素關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雌性Wistar大鼠48只，體重200 g，購自華阜康生物科技有限公司，生產許可證編號: SCXK(京)2009-0007，動物使用許可編號:SYXK (京)2008-0025。動物隨機分為4組:基礎飼料組(basal diet，BD)，基礎飼料去勢組(basal diet castrate，BDC)，亞麻籽粉組(flax seed，FS)，亞麻籽粉去勢組(flax seed castrate，FSC)，每組12只。

1.2 實驗儀器、材料、試劑及配制方法

二甲基苯蒽(7，12-Dimethylbenz［α］anthracene，DMBA)購自美國sigma公司。吐溫80購自北京化學試劑公司。1g DMBA溶于2 mL吐溫80，充分攪拌，乳化均勻后加入麻油至50 mL，振蕩助溶，終濃度20 mg/mL。大鼠基礎飼料購自北京華阜康生物科技有限公司;亞麻籽粉飼料為基礎飼料中添加10%的亞麻籽粉。戊巴比妥鈉購自北京索萊寶科技有限公司。脫毛劑為8%的硫化鈉溶液，硫化鈉購自北京化學試劑公司。稱取8g硫化鈉加入40 mL 75%的酒精，溫水定容到100 mL。光學顯微鏡型號:OLYMPUS，BH-2。

1.3 模型制作

全部大鼠基礎飼料飼喂，每籠兩只隔離飼養，溫度22～24℃，濕度50%～60%，飲用過濾水，飼料自由采食。適應性飼養一周后灌胃，以二甲基苯蒽灌胃復制乳腺癌大鼠模型，劑量為20 mg/100 g體重。灌胃后一周，建立大鼠去勢模型，去勢組行卵巢切除手術，非去勢組行假手術。大鼠手術當日晨起禁食禁水，行3%的戊巴比妥鈉50 mg/kg體重肌肉注射麻醉，脊柱雙側消毒，鋪巾，皮膚剪口，鈍性剝離至腹腔，結扎輸卵管，切除卵巢，縫合肌肉層及皮膚，注射青霉素，放回鼠籠。BD，FS組進行假手術對照，只進行脊柱雙側切口，卵巢附近的部分脂肪切除及肌肉皮膚縫合，一周后拆線。動物摘除卵巢后逐只進行陰道涂片檢查，參照正常大鼠性周期陰道細胞變化標準，連續觀察5 d，陰道上皮細胞無周期性變化，證明去勢模型建立成功。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般狀況觀察每天觀察記錄大鼠一般狀況和大鼠死亡情況，記錄大鼠腫瘤初發時間及部位，每周稱量并記錄大鼠體重、瘤體體積，處死后剝離瘤體稱重。

1.4.2 病理組織學觀察21周后斷頸處死大鼠，觀察并記錄乳腺腫塊數量、形態及大小。取材參考國內常用大鼠乳腺取材方法，沿頸部至腹股溝備皮后，將6對乳腺連同周圍皮膚、皮下組織取下，PBS漂洗，10%福爾馬林固定24 h，乳腺組織自乳頭部對半切開，石蠟包埋，每個乳腺組織連續切片10張，二甲苯脫蠟，進行常規HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下組織學觀察乳腺腺體和導管上皮變化，以及相關改變的組織病理學特征。

1.5 計算方法

1.5.1 單純性增生:單純性增生發生率=乳腺單純性增生大鼠數/該組存活大鼠數×100%

平均單純性增生數=大鼠單純性增生發生總數/該組乳腺單純性增生大鼠數

單純性增生抑制率=(基礎組平均單純性增生數－給藥組平均單純性增生數)/基礎組平均單純性增生數)×100%。

1.5.2 不典型增生:不典型增生發生率=乳腺不典型增生大鼠數/該組存活大鼠數×100%

平均不典型增生數=大鼠不典型增生發生總數/該組乳腺不典型增生大鼠數

不典型增生抑制率=(基礎組平均不典型增生數－給藥組平均不典型增生數)/基礎組平均不典型增生數)×100%。

1.5.3 乳腺癌:乳腺癌發生率=癌變大鼠數/該組存活大鼠數×100%

平均癌變數=大鼠癌變發生總數/該組癌變大鼠數

抑癌率=(基礎組平均癌變數－給藥組平均癌變數)/基礎組平均癌變數×100%。

比較各組單純性增生、不典型增生、乳腺癌發生情況，評價亞麻籽粉木酚素對乳腺單純性增生、癌前病變、乳腺癌生長的抑制作用。

1.6 統計學分析處理

所有數據均采用SPSS16.0進行統計分析，結果用ˉx±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著意義，P＜0.01為差異具有極其顯著意義，繪圖采用Microsoft Excel軟件。

2 結果

2.1 一般狀況

48只實驗大鼠有3只死于腹瀉，其余45只大鼠在實驗結束時均存活;存活各組大鼠體重無明顯差異，見表1，飼料中添加亞麻籽粉對大鼠生活質量無明顯影響。BDC組和BD組分別在誘癌劑灌胃給藥后第11周和第13周首次出現可觸及的乳腺部位腫塊;而FS，FSC組在給藥后第15周開始出現可觸及腫塊。記錄可觸及的大鼠腫塊數，病理診斷區分腫塊性質。大體觀察腫瘤位于乳腺部位、質硬，并呈侵襲性生長，與乳腺組織間無明顯分離，大的腫瘤可占據整個乳腺或超出乳腺范圍，個別可見侵及皮膚并形成潰爛。腫瘤瘤重及體積見表2。圖1示不同組大鼠乳腺體表可觸及腫瘤的生長情況，結果顯示不同時期亞麻籽粉組大鼠腫瘤體積和重量均明顯小于基礎組，可見亞麻籽粉組大鼠腫瘤初發時間較基礎組晚，解剖未發現肝、肺等重要臟器轉移灶。

表1 各組大鼠平均體重Tab．1Average body weight of rats in each group

2.2 大鼠病理組織學觀察結果

光鏡觀察結果顯示各組大鼠均發生單純性增生、不典型性增生及癌變(彩插6圖2)，同一大鼠的多個乳腺出現不同程度的增生或癌變。正常乳腺導管可見導管上皮細胞排列有序，無明顯炎性細胞浸潤和間質結締組織增生;單純性增生可見導管上皮細胞失去正常的結構和層次;不典型增生可見導管上皮細胞排列較亂，細胞層次增多，極向消失，增生的細胞大小不一，可見核分裂象。浸潤性乳腺癌可見細胞排列失去極性，排列紊亂，核深染，病理性核分裂像常見。

2.3 評定指標及標準

乳腺增生情況參照人體乳腺不典型增生診斷標準評定。統計并比較分析各組單純性增生數、不典型增生(癌前病變)病灶數以及癌變病灶數，單純性增生統計指標包括小葉增生、導管上皮增生、結締組織增生、導管內增生;不典型增生統計指標包括導管上皮不典型增生;癌變統計指標包括導管內癌、小葉原位癌、浸潤性癌等，結果見表3;計算相應抑制率，結果體現亞麻籽粉組大鼠單純性增生，不典型增生，癌變病灶數目均低于相應基礎組，其中FS組的誘發癌變抑制率明顯高于FSC組。大鼠結腸病理組織學觀察部分有淋巴細胞浸潤，無癌前期和癌的改變。

表2 體表可觸及的乳腺癌瘤體平均重量及體積比較Tab.2Comparation of palpable tumor weights and volumes

圖1 亞麻籽粉及去勢對DMBA誘發大鼠體表可觸及的乳腺癌瘤體生長的影響Fig．1Impaction of Flax seed powder and castrated to DMBA-induced surface palpable breast tumor growth

3 討論

乳腺癌是成年女性最易患的惡性腫瘤之一，在歐美發達國家其發病率高居女性癌癥首位，是女性的主要死因之一。據世界衛生組織國際癌癥研究中心(IARC)最近的估計(GLOBOCAN 2008)，全球年新發女性乳腺癌病例達138萬，占全部女性惡性腫瘤發病的23%;死亡46萬，占所有女性惡性腫瘤死亡的14%;近年來，我國乳腺癌發病率呈現快速明顯上升的趨勢，目前我國約有47萬乳腺癌患者，城市地區乳腺癌的發病率和死亡率均位于女性常見惡性腫瘤前三位［3］。因此，如何降低乳腺癌的發病率和死亡率，開展對乳腺癌的發病和復發的預防的相關研究具有重要的實際應用價值。

表3 DMBA誘發各組大鼠乳腺上皮單純性增生、不典型增生、乳腺癌的發生情況Tab．3The incidence of DMBA-induced mammary hyperplasia，mammary atypical hyperplasia and mammary carcinoma in rats

木酚素屬于植物類雌激素，是一種與動物雌激素結構相似的生物活性物質，其在亞麻籽中的含量取決于亞麻的品種、種植氣候和生態條件，一般約占籽重量的0.9%～1.5%，比其它66種已知含木酚素的植物高100～800倍。近年研究發現木酚素在預防糖尿病及心血管疾病、發揮弱雌激素及抗雌激素效應、降血壓、調節膽固醇代謝、抗艾滋病病毒和抗肝炎病毒、預防和治療激素依賴腫瘤等方面都能發揮重要作用［4］，其中，木酚素對乳腺癌的預防和治療功能的研究更是成為當今乳腺癌相關研究的熱點。

木酚素在動物消化道內被微生物轉化成動物木酚素，即腸二醇和腸內酯，二者均具有雌激素樣和抗雌激素樣生物活性，它們與體內雌激素雌二醇結構相似，能競爭性結合雌激素受體，從而抑制與雌激素相關的細胞和腫瘤的增殖［5，6］，因而可對激素相關性疾病和腫瘤表現出一定的治療作用。乳腺癌是激素依賴性的惡性腫瘤，研究亞麻籽粉木酚素在乳腺癌發生、發展中的干預和預防作用及其與雌激素的關系，將為預防和治療乳腺癌的發生和復發提供重要的科學依據。

化學致癌劑二甲基苯蒽可誘導Wistar大鼠發生乳腺單純性增生、不典型增生、原位癌和浸潤性乳腺癌，并表現為漸進的譜帶演變過程［7，8］，這個過程與人體乳腺癌癌變過程極為相似，因此建立可靠科學的動物研究模型，研究木酚素對誘發乳腺癌前病變以及乳腺癌的抑制作用，可為探討乳腺癌的有效預防，以及研究木酚素預防乳腺癌的機制和效果產生重要影響;建立大鼠去勢模型研究雌性激素對亞麻籽粉木酚素抑癌作用的影響，在理論上可闡明亞麻籽粉木酚素的抑癌作用與雌性激素間的關系以及作用結果，將揭示影響木酚素抑制乳腺癌作用的途徑和機制，對于乳腺癌的預防和術后復發的控制和管理具有重要的指導價值。

由于人類和大鼠處于不同的生物階梯，藥物在體內作用過程和藥效機制不可能完全相同［9，10］，且人類患癌可能會受到心理相關因素的影響，所以該研究結果尚不能完全用來解釋木酚素對人類乳腺癌的預防功能和作用機理，乳腺癌大鼠去勢模型不能完全替代人類絕經后代謝的改變，因此利用木酚素代替或輔助藥物防癌抗癌尚需要后續人群研究加以證實，但木酚素在預防癌前病變，抑制癌細胞生長、降低血膽固醇水平等方面的研究確實展現出可喜的前景［11］，且我國藥用資源廣泛，研究費用低，因此對木酚素進行深入研究，特別是對其防治乳腺癌的應用研究具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景。

［1］Jianmin C，Jasdeep KS，Paul C，et al．Flaxseed and pure secoisolariciresinol diglucoside，but not flaxseed hull，reduce human breast tumor growth(MCF-7)in athymic mice［J］．Nutrition And Disease，2009，66(10):206－212．

［2］Katharina B，Aida KZ，Alina V，et al．Meta-analyses of lignans and enterolignans in relation to breast cancer risk［J］．Am J Clin Nutr，2010，12(2):141－148．

［3］Louis WC，Mary NC，Wings TL，et al．A rat cell line derived from DMBA-induced mammary carcinoma［J］．Life Sciences，2003，13(3):27－33．

［4］Cecile VS，Pierre D，Christe P，et al．Phytoestrogen rich diets modulate expression of brca1 and brca2 tumor suppressor genes in mammary glands of female Wistar rats［J］．Cancer Research，2003，63(10):6607－6612．

［5］Masao H，Atsuko M，Nobuyuki I，et al．Effects of dietary perila oil，soybean oil and safflower oil on 7，12-dimethylbenz［a］antfhracene(DMBA)and 1，2-dimethylydrazine(DMH)-induced mammary gland and colon carcinogenesis in female SD rats［J］．Carcinogenesis，1990，11(5):731－727．

［6］Zhou YJ，Liu YE，Cao JG，et al．Vitexins，nature-derived lignan compounds，induce apoptosis and suppress tumor growth［J］．Clin Cancer Res，2009，15(16):112－118．

［7］Dal ML，Zucchetto A，Talamini R，et al．Effect of obesity and other lifestyle factors on mortality in women with breast cancer［J］．Int J Cancer，2008，12(3):2188－2194．

［8］Susan EM，Paola M，Stephen B，et al．Dietary lignan intakes and risk of pre-and postmenopausal breast cancer［J］．Int J Cancer，2004，11(1):440－444．

［9］Anazi AF，Qureshi VF，Arbieri C，et al．Preventive effects of phytoestrogens against postmenopausal osteoporosis as compared to the available therapeutic choices:an overview［J］．J Nat Sci Biol Med，2011，2(2):154－163．

［10］Huis R，Morreel K，Fliniaux O，et al．Natural hypolignification is associatedwithextensive oligolignol accumulationinflax stems．Plant Physiol，2012，2(13):342－351．

［11］Dong K，Pu JX，Zhang HY，et al．Lignans from Kadsura polysperma and Their Antineurodegenerative Activities［J］．J Nat Prod，2012，75(2):249－256．

Study of the Flaxseed Lignan on the Animal Model of Breast Cancer Prevention and the Relation with the Body Estrogen

LIU Shan1，WANG Xiao-bing1，LI Ai-dong2，LIU Zhao-yang1，TIAN Hai-mei1，LI Mo1，ZHAO Wen-ya1，LI Yan-fen1，LIU Jing1，SONG Pei-pei1，ZHANG Wei1
(1.Detection Center of Tumor Biology，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Central Laboratory，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo explore the function of flaxseed powder lingans on the prevention of breast cancer and the relation with estrogen on the ovariectomized female rats．MethodsFouty-eight female wistar rat were randomly divided into basal diet group(BD)，basal diet castrate group(BDC)，flaxseed group(FS)and flaxseed castrate group(FSC)，Allof the rats were treated with DMBA by intragastric administration at a dose of 2mg/kg weight to establish the experimental animal models of induced breast cancer and the BDC and FSC groups were operated for the ovariectomy．On the 21 week the volume and weight of the palpable tumors were measured and conducted pathological examination by pathologist．ResultsThe experimental animals were generally in well situation，there was no obvious toxic or side effect in experimental groups，palpable tumors appeared two to four weeks later in FS and FSC groups than that in the control; Compared with the control groups，the incidence and the average number of lesions of breast hyperplasia，atypical hyperplasia，breast cancer were significantly lower in flaxseed groups(hyperplasis:FS vs BD，P=0.006＊＊;FSC vs BDC，P＜0.001＊＊;atypical hyperplasia:FS vs BD，p=0.048*;FSC vs BDC，P＜0.014*;breast cancer:FS vs BD，P=0.028*; FSC vs BDC，P=0.047*)，additionally，the volume and weight of the tumors were lower in flaxseed groups．The results also suggested that the ability of inhibiting the hyperplasia and tumor cell growth of the flaxseed lignans is related with estrogen states(hyperplasis:P=0.008＊＊;atypical hyperplasia:P=0.042*;Breast cancer:P=0.033*)．ConclusionsFlaxseed powder lignans can effectively prevent and reduce the occurrence of breast cancer，precancerous lesions and hyperplasia induced by DMBA，and the preventive effect of flaxseed powder lignans are affected by body estrogen．The above results may be of reference value for screening effective population and preventing breast cancer by lignans．

Lingans;Flax seed;Rat;Breast cancer

R730.1;R737.9 R332

A

1671-7856(2012)06-0043-05

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．06．010

2012-05-09

國家自然科學基金資助項目(81071714)。

劉珊(1985－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤預防。E-mail:candy_show@yeah．net。

張偉，男，研究員，E-mail:zhangww1954@126．com。