椎間盤內注射轉化生長因子-β1 誘導椎間盤退變

高春華，呂 明，楊 誠，龐曉東，李端明，楊 洪，彭寶淦

椎間盤退變是引起慢性腰痛的主要原因之一，也是一個非常復雜的生物學過程。Peng 等［1-3］一系列研究發現，疼痛椎間盤在細胞的組成和結構上均與無疼痛癥狀的退變椎間盤不同。疼痛的椎間盤首先是一個退變的椎間盤，病理特征性是椎間盤內形成富含神經纖維的炎性血管化肉芽組織，一些生長因子如堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growing factor，bFGF)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)大量表達;老化椎間盤雖然是一個退變的椎間盤，但盤內無血管肉芽組織形成，僅有少量生長因子的表達。TGF-β1是一種穩定的多功能的多肽生長因子，能提高體外培養的髓核細胞的蛋白多糖合成作用［4］，它們不僅可以控制機體的發育、生長，還可控制組織的再生和創傷愈合，也能促進組織的不正常改變。在疼痛椎間盤，bFGF、TGF-β1 和CTGF 既在肉芽組織內大量表達，也在非肉芽組織部位表達。近期有研究表明，退變椎間盤內注射生長因子可以通過改善髓核細胞內環境進而延緩椎間盤退變，但從目前的研究結果可以看出，生長因子廣泛存在于退變的椎間盤內，該物質對椎間盤退變的各個時期是否都起到一定的修復作用亦或可以促進椎間盤的退變尚不得而知。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

10 只6月齡的雄性山羊，平均體重為30 kg。

1.2 觀察指標

1.2.1 腰椎側位X 線片椎間盤高度變化

拍攝腰椎正側位X 線片，測量L4/L5/L6/L7椎間隙高度。采用島津500 型數字X 線機于術后2、4、6個月時分別觀察測量椎間盤高度指數(disk height index，DHI)。測量時山羊行全身麻醉后自然放置檢查臺上，以L5椎體為投照中心拍攝山羊腰椎側位X線片。測量精度0.1 mm。測量及計算方法見圖1。

圖1 DHIFig.1 DHI

1.2.2 椎間盤退行性病變程度

采用德國Siemens 公司1.5T 超導型MRI 掃描儀，置于腰椎掃描表面線圈內，自旋回波脈沖系列成像。掃描參數:T2 加權TR/TE 為4 500/130 ms，矢狀位掃描層厚2 mm，層間隔0 mm;在中矢狀位T2加權像上運用MRI 掃描儀自帶軟件MR2002M 對椎間盤髓核高信號區進行描記，自動測量高信號區面積。

1.2.3 組織學評價

觀察椎間盤標本的組織學變化，參考Masuda 評分［5］標準，比較3組椎間盤的組織學評分。

1.3 動物處理

實驗動物肌注速眠新(0.3 mL/kg)和氯胺酮(40 mg/kg)進行全身麻醉，剪去背中部和左肋脅部毛發，取右側臥位，手術區分別用碘酒和酒精消毒，從肋床下緣約4 cm 偏離椎旁肌2 cm 縱形切開皮膚直到骨盆環。小心分離皮下組織、腹膜外脂肪和椎旁肌暴露L3～7椎體前外側(山羊有7 個腰椎)。術中定位:山羊髂嵴水平正對L7，觸摸到的腰椎間盤前方最凸點為椎間盤前正中點。仔細暴露出L4/L5/L6/L7椎間盤前方纖維環穿刺點，用皮試針頭經椎間盤前正中平行于臨近上下終板小心刺入髓核(刺入髓核時有明顯的落空感)。L4/L5椎間盤注入0.2 mL 生理鹽水作為對照椎間盤，L5/L6椎間盤注入0.2 mL TGF，L6/L7椎間盤注入0.2 mL FGF。完成操作后，用不吸收線逐層縫合深、淺筋膜和皮膚。在整個操作過程中注意不破壞椎體的骨膜組織和上下終板。分別于術前、手術結束時和術后3 d 肌注青霉素2.5×105U/kg。

1.4 標本收集與處理

術后2、4、6 個月時分別觀察測量一下指標所有動物每3周檢測1 次，記錄X 線片上椎間盤的高度指數和MRI T2 加權像上的椎間盤高信號區的面積、椎間盤的形態學變化。術后6 個月通過靜脈注入氯化鉀溶液將其處死，取下L4/L5/L6/L7節段的椎間盤(切下的范圍包括前縱韌帶、外層纖維環、纖維環穿刺道及部分髓核)，并根據標本來自間隙的不同，將標本分為L4/L5、L5/L6和L6/L73組。將取下的標本分別經固定、脫鈣、石蠟包埋并切片之后，對組織病理切片HE 染色、Masson 三色膠原染色和番紅O-固綠染色。觀察3組椎間盤標本的組織學變化。

2 結 果

2.1 影像學觀察結果

2.1.1 X 線結果

術后6 個月行腰椎X 線檢查時發現，L4/L5和L6/L7椎間隙未見明顯變化，無明顯椎間隙變窄及椎體骨贅形成跡象，而L5/L6椎間隙則在術后6 個月與術前相比有明顯椎間隙變窄和骨質增生反應(見圖2)。

圖2 DHI 變化Fig.2 Changes of DHI

2.1.2 MRI 檢查

術前山羊腰椎序列整齊，椎間盤未見退變征象，椎間隙高度基本一致，術后6 個月復查可見腰椎序列紊亂，椎間盤出現高度丟失，體積縮小，椎體邊緣骨橋形成等退變征象。MRI 高信號區面積變化見圖3。

2.2 組織學觀察結果

圖3 MRI 高信號區面積變化Fig.3 Changes of hyperintense area in MRI

在術后6 個月將切下的椎間盤標本染色并在光學顯微鏡下觀察發現，術后椎間盤即L5/L6椎間盤纖維環穿刺道內有明顯的軟骨樣細胞增生，纖維排列雜亂，髓核含水量減少;而L4/L5和L6/L7椎間盤標本在光鏡下觀察發現，纖維環內外層始終分界清楚，表現為正常的板層樣結構。3組椎間盤組織學評分變化見圖4。

圖4 椎間盤組織學評分變化Fig.4 Changes of histological scores of intervertebral discs

3 討 論

椎間盤退變發生率高，危害較大，但確切的發生機制尚不完全清楚。生長因子在體外能控制細胞的增殖或分化，在體內能介導細胞之間的相互作用。它們不僅可以控制機體的發育、生長，還可控制組織的再生和創傷愈合.但也可促進組織的不正常改變。bFGF、TGF-β 通過各自的受體信號轉導通路促進成纖維細胞和血管內皮細胞等間質細胞增殖和合成膠原蛋白，是對創傷修復具有重要調控作用的生長因子。bFGF 作為一種重要的促有絲分裂原，它可以直接作用于組織修復細胞(如成纖維細胞)周期，使細胞G1 期比例下降，S 期和G2+M 期比例增加，使細胞周期轉換時間縮短，加速細胞的分裂和增殖。TGF-β 作為一種多功能生長因子，除作為化學催化劑催化炎性細胞與組織修復細胞向創面聚集外，本身還能直接作用于成纖維細胞，刺激細胞外基質中Ⅰ型前膠原合成、肉芽組織生長以及修復后期的組織重建等。TGF-β1 是蛋白多糖及膠原代謝等椎間盤細胞外基質的重要調節物質之一，在椎間盤退變過程中扮演重要角色，既具有誘導某些細胞的促凋亡反應，又能增強某些細胞的抗凋亡作用。

但外源性TGF-β1 和bFGF 注入正常椎間盤內，椎間盤會發生何種變化，目前尚無確切報告。本實驗通過將外源性TGF-β1 注入羊L5/L6正常椎間盤內，L4/L5椎間盤注入0.2 mL 生理鹽水作為正常對照，L6/L7椎間盤注入0.2 mL FGF 作為陽性對照。通過X 線片測量腰椎DHI，腰椎MRI T2 加權像測量椎間盤高信號區的面積和Msuda 椎間盤評分變化，結果顯示:外源性TGF-β1 可以明顯使椎間盤DHI 降低、核磁椎間盤高信號面積減少，椎間盤病理學評分增加。FGF組也有變化，但較TGF-β1組改變輕。

本研究結果顯示外源性TGF-β1 注入正常椎間盤內，椎間盤會發生退行性改變。其原因可能是隨著TGF-β1 濃度升高及其自分泌調控機制，TGF-β1在椎間盤中的含量也不斷增多，其對膠原合成的正向調節作用不斷增強，導致Ⅰ型膠原合成增加量進一步增加，并逐漸取代Ⅱ型膠原，使得髓核承受壓力及形變能力降低，最終整個椎間盤發生纖維化。這也可能是TGF-β1 導致椎間盤退變機制之一。

另外，TGF-β1 注射進椎間盤內，激發其局部炎癥血管反應，炎癥部位的細胞大量產生生長因子，如bFGF 和CTGF 等，這些生長因子作用于與循環系統隔絕的椎間盤細胞，通過信號轉導促進了椎間盤細胞的分化，可能導致椎間盤纖維化和退變。

本實驗樣本量較小，仍需同道對椎間盤退變的確切機制進行進一步研究。

［1］Peng B，Wu W，Hou S，et al.The pathogenesis of discogenic low back pain［J］.J Bone Joint Surg Br，2005，87(1):62-67.

［2］Peng B，Hou S，Wu W，et al.The pathogenesis and clinical significance of a high-intensity zone(HIZ)of lumbar intervertebral disc on MR imaging in the patient with discogenic low back pain［J］.Eur Spine J，2006，15(5):583-587.

［3］Peng B，Hao J，Hou S，et al.Possible pathogenesis of painful intervertebral disc degeneration［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2006，31(5):560-566.

［4］An HS，Takegami K，Kamada H，et al.Intradiscal administration of osteogenic protein-1 increases intervertebral disc height and proteoglycan content in the nucleus pulposus in normal adolescent rabbits［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):25-31.

［5］Masuda K，Aota Y，Muehleman C，et al.A novel rabbit model of mild，reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture:correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(1):5-14.