原發(fā)性高血壓患者血漿色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸濃度的變化

徐冰馨， 詹一鳴， 高平進(jìn)， 朱鼎良， 趙建幸

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海市高血壓研究所，上海 200025)

原發(fā)性高血壓患者血漿色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸濃度的變化

徐冰馨， 詹一鳴， 高平進(jìn)， 朱鼎良， 趙建幸

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院上海市高血壓研究所，上海 200025)

目的 通過(guò)測(cè)定血漿色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)濃度，探討外周吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)和犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(KAT)活性與原發(fā)性高血壓(EH)的關(guān)系。方法 采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定100例EH患者和80名健康體檢者(對(duì)照組)血漿TRP、KYN和KYNA濃度，計(jì)算產(chǎn)物/底物的百分比來(lái)評(píng)價(jià)酶活性，即IDO活性=KYN/TRP×100%，KAT活性=KYNA/KYN×100%。結(jié)果 EH組血漿TRP濃度為(59．85 ±9．89)μmol/L，明顯高于對(duì)照組［(48．19 ±7．72)μmol/L，P ＜0．001］;KYN 濃度為(2．01 ±0．48)μmol/L，明顯低于對(duì)照組［(2．17±0．43)μmol/L，P ＜0．05］。EH 組和對(duì)照組血漿 KYNA 濃度分別為(24．10±9．12)、(23．59 ±7．27)μmol/L，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞ 0．05)。EH 組 IDO 活性為 3．40% ±0．85%，明顯低于對(duì)照組(4．54% ±0．81%，P ＜0．001);而 KAT活性為 1．20% ±0．36%，明顯高于對(duì)照組(1．09% ±0．27%，P ＜0．05)。EH 組血漿 TRP 濃度與年齡呈負(fù)相關(guān)(r= －0．316，P=0．001)，而對(duì)照組二者之間無(wú)明顯相關(guān)性(r=－0．208，P=0．064)。EH組和對(duì)照組血漿IDO活性均與年齡呈正相關(guān)(EH組:r=0．264，P=0．008;對(duì)照組:r=0．305，P=0．006)。2組血漿KYN、KYNA濃度及KAT活性與年齡均無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論EH組血漿TRP濃度明顯增高而KYN濃度明顯降低，提示外周TRP-KYN代謝途徑的IDO活性可能與EH有關(guān)。

色氨酸;犬尿氨酸;犬尿喹啉酸;吲哚胺2，3-雙加氧酶;犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;原發(fā)性高血壓

色氨酸(TRP)是一種人體必需氨基酸。從食物攝入的TRP除參與蛋白質(zhì)合成外，還通過(guò)5-羥色胺(5-HT)和犬尿氨酸(KYN)代謝途徑在相關(guān)酶的催化下生成多種重要的生物活性物質(zhì)，參與體內(nèi)生理活動(dòng)。超過(guò)95%的TRP在吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)催化下生成KYN［1］，然后在犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(KAT)作用下生成犬尿喹啉酸(KYNA)，或在KYN羥化酶作用下轉(zhuǎn)變成3-羥基犬尿氨酸，并進(jìn)一步代謝為3-羥基鄰氨基苯甲酸、喹啉酸等。有研究表明，TRP、KYN和KYNA對(duì)血壓有調(diào)節(jié)作用。Wolf等［2］發(fā)現(xiàn)靜脈注射低劑量TRP能引起自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和血壓正常的大鼠(WKY)血壓升高。Wang等［3］研究證明靜脈給予KYN能呈劑量依賴性地降低SHR的平均動(dòng)脈壓(MAP)，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的IDO活性增強(qiáng)時(shí)血中TRP濃度降低，KYN濃度升高，導(dǎo)致血壓降低，而通過(guò)使用藥物抑制IDO活性能增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血壓，IDO基因缺乏小鼠的MAP顯著高于對(duì)照組。KYNA是N-甲基D-天門冬氨酸受體(NMDAR)拮抗劑，能夠拮抗由谷氨酸和NMDAR介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KYNA可能與血壓的中樞調(diào)節(jié)有關(guān)［4］，其對(duì)血壓調(diào)節(jié)的作用位點(diǎn)位于延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(RVLM)的血壓中樞調(diào)控區(qū)，通過(guò)調(diào)控該區(qū)域NMDAR完成。有研究顯示SHR的腎皮質(zhì)KAT活性低于相同周齡的WKY，且尿中KYNA含量亦顯著低于WKY［5］。

原發(fā)性高血壓(EH)是最常見(jiàn)的心血管疾病，占高血壓的95%以上，是以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為主要特點(diǎn)，由多基因遺傳、環(huán)境及多種危險(xiǎn)因素相互作用所致的全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。目前關(guān)于TRP-KYN代謝途徑與血壓調(diào)節(jié)相關(guān)性的研究工作多見(jiàn)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在高血壓患病人群中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們使用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定EH患者血漿TRP、KYN和KYNA濃度并通過(guò)計(jì)算KYN/TRP和KYNA/KYN比值得到IDO和KAT活性，以探討其與EH的關(guān)系。

材料和方法

一、研究對(duì)象

1．對(duì)照組 選擇瑞金醫(yī)院體檢中心的健康體檢者80名，男39名，女41名，年齡23～69歲。

2．EH組 選擇瑞金醫(yī)院高血壓科的住院患者100例，男50例，女50例，年齡18～84歲，均符合2005年中國(guó)高血壓指南中關(guān)于高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除繼發(fā)性高血壓。由于腎臟功能受累會(huì)導(dǎo)致患者血漿TRP濃度降低和KYN、KYNA濃度增高［2］，因此本研究對(duì)象還按2004年美國(guó)腎臟病基金會(huì)制定的慢性腎臟病(CKD)臨床實(shí)踐指南排除了所有CKD患者。

二、血漿TRP、KYN和KYNA濃度測(cè)定

1．樣本采集及處理 早晨空腹取靜脈血，肝素鈉抗凝。1 800×g離心5min，取上清血漿置于－20℃儲(chǔ)藏。待測(cè)血漿于測(cè)定當(dāng)天臨用前溶解，取150μL于0．5 mL塑料離心管中，加入等量0．6 mol/L高氯酸振蕩充分混合，4℃ 8 000×g離心5 min，取上清液150μL置于樣品瓶中的微量樣品管中，蓋緊密閉待測(cè)。

2．測(cè)定方法 參照先前建立的同時(shí)測(cè)定血漿TRP、KYN 和 KYNA 濃度的 HPLC［6］。儀器為安捷倫1100液相色譜儀［帶有可變波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)檢測(cè)器(VWD)和熒光檢測(cè)器(FLD)］。VWD和FLD由1根長(zhǎng)15 cm、內(nèi)徑為0．18 mm的 PEEK管相連。分析柱為安捷倫HC C18(2)反相色譜柱。流動(dòng)相由20 mmol/L乙酸鈉、3 mmol/L乙酸鋅和7%乙腈組成，用前0．45μm濾膜過(guò)濾，超聲波脫氣15 min，等度洗脫，流速1．0 mL/min。進(jìn)樣量100μL，柱溫為室溫。VWD波長(zhǎng)365 nm;FLD激發(fā)波長(zhǎng)344 nm，發(fā)射波長(zhǎng)398 nm。分析時(shí)間40 min。用標(biāo)準(zhǔn)加入法峰面積積分計(jì)算結(jié)果，數(shù)據(jù)處理由HP Chemstation色譜工作站完成。TRP、KYN和 KYNA標(biāo)準(zhǔn)品貯備液濃度為1 mmol/L，乙腈為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品(HPLC/SPECTRO)，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｔ囼?yàn)用水為石英雙蒸水。

3．IDO和KAT活性 以產(chǎn)物/底物的百分?jǐn)?shù)表示，即IDO活性=KYN/TRP×100%;KAT活性=KYNA/KYN×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析由 GraphPad Prism 4．00和 SPSS 13．0軟件完成。測(cè)定結(jié)果以ˉx±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EH組和對(duì)照組TRP、KYN、KYNA濃度及IDO、KAT活性比較

EH組血漿TRP、KYN濃度及IDO、KAT活性與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05、P＜0．001)。KYNA濃度2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。見(jiàn)表1。

二、血漿TRP及其代謝產(chǎn)物濃度與年齡的相關(guān)性分析

EH組血漿TRP濃度與年齡呈負(fù)相關(guān)，而對(duì)照組二者之間無(wú)相關(guān)性。EH組和對(duì)照組血漿IDO活性均與年齡呈正相關(guān)，血漿KYN、KYNA濃度及KAT活性與年齡均無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表1 EH組和對(duì)照組血漿TRP、KYN、KYNA濃度及IDO、KAT活性比較(ˉx±s)

表2 血漿TRP、KYN、KYNA濃度及IDO、KAT活性與年齡的相關(guān)性分析

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，EH患者血漿TRP濃度顯著增高而KYN濃度顯著降低，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)年齡進(jìn)行校正后統(tǒng)計(jì)結(jié)果依舊，提示外周IDO活性下降。這支持外周TRP和KYN對(duì)血壓具有調(diào)節(jié)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［2-3］，TRP的增加能促使血壓升高，但這種作用受到TRP劑量的影響，TRP劑量增加到某一閾值時(shí)反而會(huì)促使血壓下降，其原因可能是高劑量TRP通過(guò)5-HT代謝途徑產(chǎn)生大量5-HT引起血壓下降［7］。高劑量TRP還通過(guò)KYN代謝途徑產(chǎn)生大量KYN，而最新研究結(jié)果表明KYN是一種血管內(nèi)皮舒張因子，能通過(guò)腺嘌呤和鳥苷酸環(huán)化酶途徑減少血管的收縮并舒張血管［3］。IDO催化反應(yīng)的底物TRP和產(chǎn)物KYN都參與了血壓的調(diào)節(jié)，IDO基因的缺失或酶活性的下降都可能促進(jìn)血壓的增加。

無(wú)論是對(duì)照組還是EH組，血漿IDO活性均與年齡呈正相關(guān)，這反映了IDO在某種程度上與生理性衰老有關(guān)。而衰老對(duì)于心血管系統(tǒng)有著廣泛負(fù)面影響，尤其是在高血壓的血管病變中，隨著年齡的增加，動(dòng)脈硬化的情況日趨嚴(yán)重。Pertovaara等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)IDO不僅與年齡呈正相關(guān)，還與頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度(IMT)呈正相關(guān)，而IMT正是早期動(dòng)脈硬化的替代標(biāo)志，能預(yù)測(cè)人群心血管事件的發(fā)生。IDO是否存在緩解動(dòng)脈硬化的作用尚需更多的試驗(yàn)證明。

KYNA可能與血壓的中樞調(diào)節(jié)有關(guān)［4］，由于KYNA經(jīng)濃度擴(kuò)散通過(guò)血腦屏障的量很小，外周KYNA濃度并不能代表其在中樞的濃度。本研究結(jié)果顯示血漿KYNA濃度2組間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EH組KAT活性的相對(duì)增加是由KYN降低造成的。通常在酶活性保持不變的情況下，底物濃度的降低會(huì)引起產(chǎn)物濃度的相應(yīng)降低，但EH組血漿KYNA濃度與對(duì)照組相比未發(fā)生明顯變化，可能與人體KAT活性代償性增強(qiáng)有關(guān)，以維持對(duì)KYNA的正常生理需要。

本研究評(píng)估了 EH患者血漿 TRP、KYN、KYNA濃度和IDO、KAT活性，發(fā)現(xiàn)EH患者的血漿TRP濃度顯著增加而KYN濃度顯著降低，表明EH患者外周IDO活性顯著低于對(duì)照人群，提示由IDO參與的TRP代謝可能參與了EH的發(fā)生和發(fā)展，具體作用機(jī)制仍有待于更深入的研究。

致謝:陳波、袁斐斐2位同志在試驗(yàn)樣本收集方面給予了支持，在此謹(jǐn)致謝意。

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［2］WolfWA，Kuhn DM．Effects of L-tryptophan on blood pressure in normotensive and hypertensive rats［J］．J Pharmacol Exp Ther，1984，230(2):324-329．

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Changes of plasma concentrations of tryptophan，kynurenine and kynurenic acid in essential hypertensive patients

XU Bingxin，ZHAN Yiming，GAO Pingjin，ZHU Dingliang，ZHAO Jianxing． (Shanghai Institute of

Hypertension，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai200025，China)

Objective To investigate the correlations between the pathogenesis of essential hypertension(EH)with peripheral indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)and kynurenine aminotransferase(KAT)activities by measuring plasma concentrations of tryptophan(TRP)，kynurenine(KYN)and kynurenic acid(KYNA)．M ethods TRP，KYN and KYNA weremeasured by high performance liquid chromatography(HPLC)in the plasma of 100 patients with EH and 80 healthy controls．The enzyme activity was estimated by calculating the percentage of product/substrate，as IDO activity=KYN/TRP×100%and KAT activity=KYNA/KYN ×100%．Results TRP concentrations were(59．85±9．89)μmol/L，which were significantly higher in patientswith EH than in healthy controls［(48．19 ±7．72)μmol/L，P ＜0．001］．KYN concentrations were(2．01 ±0．48)μmol/L，which were significantly lower in patientswith EH than in healthy controls［(2．17 ±0．43)μmol/L，P ＜ 0．05］．The concentrations of KYNA in the patients with EH were(24．10 ± 9．12)μmol/L，and were(23．59 ± 7．27)μmol/L in healthy controls，and there were no statistical significances between the 2 groups(P ＞0．05)．The IDO activity was 3．40% ±0．85%，which was significantly lower in the patientswith EH than in healthy controls(4．54% ±0．81%，P ＜0．001)．KAT activity(1．20% ±0．36%)in patients with EH was significantly higher than that in healthy controls(1．09% ±0．27%，P ＜ 0．05)．Plasma TRP concentration in the patients with EH had negative correlation with age(r= － 0．316，P=0．001)，and there was no correlation in the healthy controls(r= － 0．208，P=0．064)．Plasma IDO activity in the patients with EH and the healthy controls had positive correlation with age(EH group:r=0．264，P=0．008;control group:r=0．305，P=0．006)．There was no obvious correlation with age between the2 groups．Conclusions The increased concentrations of TRP and decreased concentrations of KYN in plasma of EH patients suggest that peripheral IDO activity in the TRP-KYN metabolism pathwaymay be involved in the pathogenesis of EH．

Tryptophan;Kynurenine;Kynurenic acid;Indoleamine 2，3-dioxygenase;Kynurenine aminotransferase;Essential hypertension

2011-08-30)

(本文編輯:龔曉霖)

1673-8640(2012)08-0624-04

R446．1

A

上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(2009206)

徐冰馨，女，1986年生，碩士，主要從事原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制研究。

趙建幸，聯(lián)系電話:021-64740165。