標本溶血對電化學發光免疫法結果的影響

陳海斌， 梁業賓， 黃慧嫦， 鄭幕陽， 蒙秀堅

(1．廣西梧州市人民醫院，廣西梧州543000;2．廣西梧州市紅十字會醫院，廣西梧州 543000)

標本溶血對電化學發光免疫法結果的影響

陳海斌1， 梁業賓1， 黃慧嫦1， 鄭幕陽1， 蒙秀堅2

(1．廣西梧州市人民醫院，廣西梧州543000;2．廣西梧州市紅十字會醫院，廣西梧州 543000)

目的 探討標本不同程度溶血對電化學發光免疫法(ECLIA)測定結果的影響。方法 將血液標本人為干預成不同程度的溶血標本，使用ECLIA檢測各組標本中的甲狀腺功能、腫瘤標志物、內分泌激素等共28項指標的濃度并做分析。結果 標本溶血可使胰島素(INS)濃度降低，使葉酸(FA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)濃度升高，重度溶血有使鐵蛋白測定結果偏高的趨勢，但差異無統計學意義，其余指標測定結果不受溶血的影響。結論 除某些項目外大部分溶血標本的ECLIA測定結果沒有受到影響。測定INS、FA、NSE時應絕對避免使用溶血標本，以確保結果準確。

溶血;胰島素;葉酸;神經元特異性烯醇化酶;鐵蛋白;電化學發光免疫法

在日常檢驗工作中，會經常遇到各種原因導致的不同程度溶血的標本。標本溶血在質量控制分析前期出現差錯的6種影響因素中占第2位，占總差錯率的26．7%［1］。標本溶血干擾或影響臨床生化、血液常規、凝血功能的測定已有廣泛的報道和綜述。電化學發光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)是一種新近發展起來的具有敏感性高、特異性強、檢測快速及無放射危害的分析技術。目前國內除對標本溶血影響這種分析技術測定個別項目如胰島素(INS)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)結果有研究外，對其他項目的研究尚未見報道。為了明確溶血對使用ECLIA測定的項目有何種影響，我們對血液標本實驗性人為干預成4種不同程度的溶血標本，測定各組標本中的腫瘤標志物、內分泌激素等共28項指標的濃度并做分析。

材料和方法

一、儀器與試劑

采用Roche公司的E601全自動電化學發光免疫分析儀及配套試劑盒。

二、不同程度溶血標本的制備

隨機抽取20份門診患者的靜脈血液，一針兩管，分別注入帶分離膠的促凝試管，其中一管37℃水浴30 min后3 000×g離心10 min，作為非溶血標本。另一管放置－20℃冰箱保存2 h后取出融化，3 000×g離心10 min，分離溶血血清，用SYSMEX XT-1800i全自動血液分析儀測定血紅蛋白(Hb)濃度，然后通過計算用相對應患者的非溶血血清調整Hb含量為8、4、2、1 g/L的溶血標本。測定人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)項目則選擇定性試驗陽性的早孕患者，標本處理方法相同。

三、測定項目

使用同一批次的試劑同時測定非溶血以及4種不同程度溶血標本的促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、甲狀腺球蛋白(Tg);促黃體生成素(LH)、促卵泡生成激素(FSH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睪酮(TESTO);甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(FPSA)、β-HCG、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原15-3(CA15-3)、糖類抗原19-9(CA19-9)、非小細胞肺癌相關抗原21-1(CYFRA21-1)、糖類抗原 72-4(CA72-4)、NSE、鐵蛋白、C-肽(C-Peptid)、INS、葉酸(FA)、維生素 B12(Vit B12)共28個項目。

四、統計學方法及評價方法

1．統計學方法 應用 SPSS Ver12．0．1 for windows統計軟件分析，測定結果以ˉx±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，每一測定項目均經方差齊性檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0．05表示差異有統計學意義。

2．溶血干擾的評價方法 按以下公式評價溶血對測定的影響:|F|=(X－X0)/X0。式中:|F|為溶血引起的誤差;X為溶血血清待測物平均濃度;X0為非溶血血清待測物平均濃度。若|F|＞0．10，表示溶血干擾客觀存在;若|F|＜ 0．10，表示溶血干擾輕微，可以忽略不計。

結 果

溶血對28項指標中4項指標產生一定的干擾。其中標本溶血可使 INS濃度降低(P＜0．05)，使FA、NSE濃度升高，且溶血程度越嚴重，變化越明顯(P ＜0．05、P ＜0．01);重度溶血有使鐵蛋白測定有使結果偏高的趨勢，但與非溶血組比較差異無統計學意義。見表1。溶血對ECLIA測定其余24項指標均無干擾。

表1溶血對ECLIA測定有干擾的項目分析(xˉ±s)

討 論

INS是一種肽類激素，主要由胰島B細胞分泌，其血清濃度測定對糖尿病分型具有重要意義。紅細胞中含有INS降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)［2-3］。IDE 是一種過氧化物水解酶，能夠高效、特異地降解INS，被認為是在細胞水平降解INS最主要的酶。隨著紅細胞的破壞，其內存的IDE釋放進入血清，能導致溶血標本INS濃度降低。本研究顯示，溶血標本的溶血程度越嚴重，INS濃度越低。

NSE作為一種存在于正常人腦組織中的細胞內酶，其血清或腦脊液中濃度異常升高是輔助診斷起源于神經內分泌細胞或神經元腫瘤(如神經母細胞瘤或小細胞肺癌)較為敏感和特異的指標，其濃度監測亦可作為評估治療效果的一種有效手段。NSE同樣也存在于紅細胞和血小板中［4］，溶血或離心不充分將會導致標本的測定結果顯著升高;鄒自英等［5］的研究表明，溶血使血清中Hb濃度每增加1克，將導致NSE測定結果增加34．53 μg/L。

FA是一種水溶性B族維生素，FA對細胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質的合成起著重要的作用，是正常代謝、DNA合成和生成紅細胞必需的物質。FA缺乏可引起巨幼細胞性貧血和白細胞減少，懷孕期間血清FA水平低下與胎兒神經管缺陷有關。紅細胞中FA濃度約為血清的16．7倍，因此溶血會導致FA測定值明顯升高。

鐵蛋白是反映儲存鐵最敏感的指標。鐵蛋白也是一種急性時相蛋白，在炎癥或腫瘤時會明顯增高，鐵蛋白廣泛分布在體液、組織和細胞中，在肝、脾、骨髓中含量最高，外周血包括紅細胞、白細胞、血小板和單核細胞都含有微量的鐵蛋白。其中紅細胞內鐵蛋白含量為0．25 fg/細胞;粒細胞為6．6 fg/細胞;淋巴細胞為 8．0 fg/細胞;單核細胞為54．6 fg/細胞［6］。由于標本溶血釋放的 Hb也是一種含鐵蛋白，在使用免疫學方法定量鐵蛋白時可能與鐵蛋白抗體存在非特異性反應，從而使測定結果偏高。本研究顯示，雖然溶血前、后鐵蛋白有增高的趨勢，但差異無統計學意義，在溶血血清Hb＞8 g/L時使用 Sonntag［7］的評價方法提示溶血干擾客觀存在。

有研究表明，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測某些腫瘤標志物如 CEA、AFP、β-HCG等項目時標本溶血會導致結果假性升高，其原因可能為紅細胞破壞釋放的亞鐵血紅素具有類似過氧化物酶的活性，其作用效應與反應體系中的標記物辣根過氧化物酶(HRP)類似，會使加入的底物液［3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)］產生顯色反應，造成假陽性或使結果偏高［8］。

有學者發現，使用放射免疫方法(RIA)測定部分甲狀腺功能、腫瘤標志物和性激素項目，輕、中度溶血對測定結果無影響，重度溶血由于稀釋效應會使結果偏低，但差異無統計學意義(P＞0．05)［9－10］。雖然 RIA 具有較強的抗干擾能力，但存在同位素放射污染風險，在臨床上已逐漸趨于淘汰。

ECLIA系統具有特異性強、敏感性高、無放射性危害及檢測快速等特點，其免疫反應原理與放射免疫和酶免疫中的競爭法、雙抗體夾心法相似，但其某些特有技術可明顯降低或避免反應體系中可能存在的非特異性干擾，如:(1)使用專利的生物素-鏈霉親和素包被技術，將以三聯吡啶釕為示蹤物質的抗原抗體復合物結合到直徑為2．8μm的磁珠載體上，這種結合體具有高度特異性和牢固性，并且鏈霉親和素不含糖基，這對檢測某些腫瘤相關糖基抗原不產生非特異性干擾;(2)通過磁性分離技術，實現了結合相與游離相的完全分離，避免了交叉污染和細胞溶解后殘留物的干擾;(3)使用可精確控制的電位差而非通過化學反應產生的化學能作為能量激發源，從而避免了某些細胞成分干擾氧化還原反應;(4)標記物三聯吡啶釕在無電場和遞電子體(三丙胺)存在的自然環境下非常穩定，因此用其標記的抗原(抗體)試劑也非常穩定。

綜上所述，雖然構成血細胞的化學成分十分復雜，但只要血細胞內不含待測物質，或者溶血后血細胞破壞釋出成分不干擾反應體系，理論上溶血對ECLIA測定結果沒有影響，除某些特定項目(INS、FA、NSE)外大部分溶血標本的測定結果仍然具有臨床意義。由于目前國內使用ECLIA檢測的儀器和試劑均依賴國外進口，成本較高，并且引起標本溶血的因素和環節較多，在臨床上不可完全避免，重復檢驗會增加患者的痛苦和經濟負擔。因此檢驗師和臨床醫師了解溶血對ECLIA測定結果的影響或干擾是很有必要的。

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Influence of sample hemolysis on electrochem ilum inescence immunoassay results

CHEN Haibin1，LIANG

Yebin1，HUANG Huichang1，ZHENGMuyang1，MENG Xiujian2． (1．GuangxiWuzhou City People's Hospital，Guangxi Wuzhou 543000，China;2．GuangxiWuzhou Red Cross Hospital，GuangxiWuzhou 543000，China)

Objective To study the influence of different degrees of sample hemolysis on electrochemiluminescence immunoassay(ECLIA)results．M ethods The blood samples were manually intervened into different degrees of hemolysis，and were used for detecting and analyzing the concentrations of 28 indices such as thyroid function，tumor markers，endocrine hormones and so on in various groups of samples．Results Sample hemolysis can reduce the concentration of insulin(INS)，and the concentration of folic acid(FA)and neuron-specific enolase(NSE)were increased．Severe hemolysis can make the results to have a higher trend on determination of ferritin，however，itwas not statistically significant，and the determination results of other indiceswas notaffected by hemolysis．Conclusions The results ofmosthemolytic samples except certain indices are notaffected．The determinations of INS，FA and NSE should absolutely avoid hemolytic samples to ensure the accuracy of results．

Hemolysis;Insulin;Folic acid;Neuron-specific enolase;Ferritin;Electrochemiluminescence immunoassay

2011-10-25)

(本文編輯:龔曉霖)

梧州市科學研究與技術開發計劃項目(201102014)

陳海斌，男，1970年生，學士，主管技師，主要從事骨髓細胞學和免疫學檢驗工作。

1673-8640(2012)08-0651-03

R446．1

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