TGF－Smad信號(hào)通路在病毒性心肌炎中的作用及銀杏葉提取物干預(yù)的研究

潘曉波，孫立雙，王晶華，孫景輝，翟淑波＊

（1.南航吉林分公司醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130031；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是兒科常見的心血管疾病，是由病毒感染引起的心肌變性、壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維素滲出為主要病理改變的疾病。VMC發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，涉及病毒的直接損傷、免疫機(jī)制、細(xì)胞凋亡、心肌纖維化、生化機(jī)制等［1－3］，因此能在 VMC發(fā)病中發(fā)揮重要作用的蛋白，必將成為調(diào)控該病的關(guān)鍵，并有望成為臨床治療該病的靶點(diǎn)。TGF－β1及其下游蛋白Smad2／3在肝、腎纖維化中發(fā)揮著重要作用［4－6］，本研究將探討TGF－Smad信號(hào)通路在病毒性心肌炎中的作用及銀杏葉提取物干預(yù)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純種近系4周齡雄性Balb／C小鼠160只，體重16－20g，飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境中，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

（2）病毒 柯薩奇病毒 B3（Coxsackie Virus B3，CVB3）（Nancy株）由吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

（3）主要試劑 TaqDNA聚合酶：Takapa公司；dNTP：Takapa公司；PCR引物：上海捷瑞生物工程公司；DNA Marker DL15000，包括片段15 000 bp、10 000bp、7 500bp、5 000bp、2 500bp、2 000 bp、1 000bp、750bp、500bp、250bp、100bp：Takapa公司；瓊脂糖：Oxoid公司。RT－PCR試劑盒：TransGen Biotech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）VMC小鼠模型的制備及分組 將160只4周齡小鼠隨機(jī)分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組為120只，對(duì)照組40只。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔接種0.1ml 102TCID50病毒液，而對(duì)照組腹腔注射等量的不含病毒的Eagel’s液，實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分為以下3組：病毒模型組（VMC，n＝40）：注射病毒后1小時(shí)后腹腔注射PBS 20μl。銀杏葉組（VMC＋GL，n＝40）：注射病毒后1小時(shí)腹腔注射銀杏葉提取物0.2ml。參麥陽(yáng)性對(duì)照組（VMC＋SM，n＝40）：注射病毒后1小時(shí)腹腔注射參麥注射液0.2 ml。連續(xù)21天。

（2）小鼠心肌組織的取材 注射病毒后第5、10、15、21天隨機(jī)取各組部分小鼠（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各取8只），取心臟，用生理鹽水沖洗干凈之后，用剪刀沿中軸線剪為兩半，一半浸泡于10%福爾馬林溶液固定后HE染色，另一半保存于液氮內(nèi)。

（3）RT－PCR 檢 測(cè) 小 鼠 心 肌 細(xì) 胞 內(nèi) TGF－β1、Smad3mRNA的表達(dá) 分別稱取組織各約為100 mg，浸在Trizol試劑中，用0.1%DEPC水處理過(guò)的毛玻璃片進(jìn)行研磨；移入1.5ml EP管中，添至1 ml Trizol試劑渦旋混勻，再冰上孵育5min；4℃條件下，12 000rpm／min離心5min，取上清液后移入1.5ml新離心管，加0.2ml氯仿，混勻，冰上孵育5 min；4℃條件下，12 000rpm／min離心10min，取上層液相移入1.5ml新離心管，加0.5ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5min；4℃條件下，12 000rpm／min離心5min棄去上清液；加入1ml 75%乙醇，4℃條件，7 500rpm／min離心5min棄去上清液，室溫下使之干燥透明，加入DEPC處理水20μl溶解RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260／280吸光度比值。

（4）引物序列引物設(shè)計(jì) Smad3、TGF－β1基因序列通過(guò) GenBank獲得，由primer5.0設(shè)計(jì)，由大連寶生物科技有限公司合成。

Smad3：上 游：5′－TCTACTGCCGCTTGTGG－′下 游：5′－TGTGGTTCATCTGGTGGTC－3′TGF－β1：上游：5′－CCAAGGAGACGGAATACAGG－3′下游：5′－GTGTTGGTTGTAGAGGGCAAG－3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌病理積分測(cè)定

對(duì)照組小鼠無(wú)任何病理變化，而病毒組小鼠則在第5天開始即出現(xiàn)明顯的病理變化，可見炎癥反應(yīng)，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死，局部出現(xiàn)少量纖維增生；第10天時(shí)炎癥進(jìn)一步發(fā)展，可見炎性病灶出現(xiàn)，壞死區(qū)域增大，纖維組織增生增多，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第15天時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸吸收，心肌纖維排列紊亂，并可見較多的纖維增生；第21天時(shí)壞死細(xì)胞由纖維組織代替，炎癥細(xì)胞明顯減少，纖維組織大量增生；藥物干預(yù)后病理積分明顯下降，且銀杏提取物組與參麥陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著。見表1。

表1 各組小鼠心肌組織病理積分（）

表1 各組小鼠心肌組織病理積分（）

注：＊＊表示與對(duì)照組比較，P＜0.01；△，△△表示與 VMC組比較，P＜0.05和P＜0.01

組別 n病理積分5天 10天 15天 21天對(duì)照組80 VMC 8 2.05±0.08＊＊ 2.34±0.09＊＊ 3.72±0.01＊＊ 3.65±0.04＊＊VMC＋SM 8 1.97±0.01△ 2.09±0.02△△ 3.13±0.07△△ 3.01±0.02△△VMC＋GL 8 1.99±0.09△ 2.16±0.01△△ 3.21±0.08△△ 3.09±0.06△△

2.2 RT－PCR檢測(cè)結(jié)果 （1）RT－PCR檢測(cè)小鼠心肌TGF－β1mRNA表達(dá)結(jié)果 見表2。各組小鼠TGF－β1在411bp處清晰可見，經(jīng)過(guò)灰度分析后可以看出對(duì)照組小鼠在各時(shí)期TGF－β1mRNA表達(dá)量維持在較低水平，病毒組小鼠各時(shí)期TGF－β1mRNA表達(dá)量則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，與對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.01，銀杏提取物作用后小鼠TGF－β1 mRNA表達(dá)量則較病毒組明顯下降，與病毒組相比差異顯著，P＜0.05，參麥陽(yáng)性對(duì)照組小鼠 TGF－β1 mRNA表達(dá)量與病毒組相比明顯下降，差異顯著P＜0.05，且參麥陽(yáng)性對(duì)照組與銀杏提取物組小鼠相比差異不顯著。

表2 各組小鼠心肌中TGF－β1mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

表2 各組小鼠心肌中TGF－β1mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

注：＊，＊＊表示與對(duì)照組比較，P＜0.05和P＜0.01；△，△△表示與 VMC組比較，P＜0.05和P＜0.01

n 5天 10天 15天 21天0.19±0.01 VMC 8 0.25±0.03＊ 0.29±0.01＊＊ 0.32±0.03＊＊ 0.38±0.01＊＊VMC＋SM 8 0.21±0.02△ 0.24±0.13△ 0.23±0.01△ 0.27±0.07△△VMC＋GL 8 0.21±0.07△ 0.23±0.01△ 0.25±0.05△ 0.26±0.01對(duì)照組8△

（2）RT－PCR檢測(cè)小鼠心肌Smad3mRNA表達(dá)結(jié)果 見表3。在336bp處清晰可見各組小鼠Smad3條帶，經(jīng)過(guò)灰度分析后可以看出對(duì)照組小鼠在各時(shí)期Smad3mRNA表達(dá)量維持在較低水平，病毒組小鼠各時(shí)期Smad3mRNA表達(dá)量則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，與對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.01，銀杏葉組、參麥組則出現(xiàn)明顯下降，與病毒組相比，差異顯著，P＜0.05，且參麥陽(yáng)性組與銀杏葉組小鼠相比差異不顯著。

表3 各組小鼠心肌中Smad3mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

表3 各組小鼠心肌中Smad3mRNA相對(duì)表達(dá)量（）

注：＊，＊＊表示與對(duì)照組比較，P＜0.05和P＜0.01；△，△△表示與 VMC組比較，P＜0.05和P＜0.01

n 5天 10天 15天 21天0.19±0.01 VMC 8 0.26±0.04＊ 0.29±0.08＊ 0.32±0.02＊＊ 0.37±0.09＊＊VMC＋SM 8 0.21±0.13△ 0.24±0.10△ 0.23±0.03△ 0.24±0.01△△VMC＋GL 8 0.22±0.07△ 0.23±0.02△ 0.21±0.08△ 0.23±0.07對(duì)照組8△△

2.3 相關(guān)性分析

病毒組小鼠心肌病理積分與免疫組化檢測(cè)TGF－β1表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r＝0.554，P＜0.05，兩者呈正相關(guān)性。病毒組小鼠心肌病理積分與免疫組化檢測(cè)Smad3表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r＝0.515，P＜0.05，兩者呈正相關(guān)性。病毒組小鼠心肌TGF－β1與Smad3表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)為r＝0.406，P＜0.05，兩者呈正相關(guān)性。

3 討論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）是許多具有共同生物學(xué)特性的信號(hào)分子組成的大家族，主要包括兩個(gè)成分，即：α和β，兩者在分子組成、受體結(jié)構(gòu)和生物活性上具有很大差異，分屬不同蛋白家族［7－8］。TGF－β家族至少有30種細(xì)胞因子組成，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和儲(chǔ)存等眾多生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，其中以TGF－β1結(jié)構(gòu)和功能的研究最為深入。研究表明［9］，低濃度 TGF－β1可以在炎癥早期刺激、聚集炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的發(fā)展，同時(shí)TGF－β1是現(xiàn)已證實(shí)的促纖維化的最重要的生長(zhǎng)因子之一，能刺激體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞膠原基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致膠原合成增加，是膠原代謝最密切的細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)［10］，TGF－β1可以促進(jìn)家兔心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原、纖維粘連蛋白等mRNA及蛋白的表達(dá)，在心肌纖維化的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT－PCR方法檢測(cè)小鼠心肌TGF－β1表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠在各時(shí)期均維持較低水平，而病毒組小鼠TGF－β1表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量逐漸增高，在第21天時(shí)表達(dá)量最高，且各時(shí)期TGF－β1表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組小鼠，差異顯著，P＜0.05，可見在病毒性心肌炎小鼠的發(fā)病中TGF－β1發(fā)揮了重要作用。通過(guò)RT－PCR方法檢測(cè)對(duì)照組小鼠和病毒組小鼠心肌Smad3的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，Smad3的表達(dá)量與TGF－β1表達(dá)量呈相關(guān)性表達(dá)，在病毒組小鼠則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，通過(guò)分別將病毒組小鼠心肌病理積分與TGF－β1、Smad3表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，病理積分與這兩個(gè)蛋白均呈正相關(guān)性，可見TGF－β1、Smad3表達(dá)量的升高促進(jìn)了病毒組小鼠心肌病理積分的發(fā)展。

銀杏葉提取物是銀杏葉經(jīng)過(guò)多步驟分離提取后得到的天然活性物質(zhì)，主要為黃酮類、萜類內(nèi)酯化合物、多糖 類 等。 研 究 證 實(shí)［11－12］，EGB 具 有 廣 泛 的 藥理作用，如拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗過(guò)敏等；研究發(fā)現(xiàn)［13］，EGB能夠通過(guò)調(diào)控TGF－β1信號(hào)通路達(dá)到抗大鼠肺纖維化及肝纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)中將銀杏提取物作用于病毒模型組小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌病理變化明顯改善、各時(shí)期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病理積分較病毒模型組明顯減小，與病毒組相比差異顯著，同參麥組無(wú)差異。銀杏葉提取物作用小鼠后可降低TGF－β1、Smad3表達(dá)量，影響TGF－β1－Smad3信號(hào)通路的活性進(jìn)而達(dá)到改善心肌炎的作用，銀杏葉提取物的作用機(jī)制也得到了進(jìn)一步的確定。

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