幽門螺桿菌毒力蛋白CagA誘導AGS細胞IL－8mRNA表達的研究

張亞南，黃柳桓，康熙雄

（1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院 檢驗科，北京100050；2.首都醫科大學石景山教學醫院 北京市石景山醫院 胸心血管外科，北京100043）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是全世界高感染率的慢性感染性致病菌，在我國普通人群的感染率高達50%－80%。自從Marshall和Warren分離培養出幽門螺桿菌以來［1］，幽門螺桿菌與慢性胃炎、潰瘍、胃腫瘤和胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤（MALT）等多種疾病相關［2］，幽門螺桿菌被世界衛生組織（WHO）定為一類致癌原（1994年國際癌癥研究大會），但是其致病機制仍不清楚。

根據是否含有40－Kb cag病原島（cag pathogenicity island，cag PAI），幽門螺桿菌被分成兩型：I型和II型［3］。I型幽門螺桿菌包含cag PAI，可引起更嚴重的胃粘膜變化。cag PAI有31個基因，CagA蛋白是唯一已知的由cag PAI編碼的功能蛋白。酪氨酸 磷 酸 化 發 生 在 cagA 的 Glu－Pro－Ile－Tyr－Ala（EPIYA）motif上，從西方型（WSS－type）H.pylori主要 由 EPIYA－A，－B 和－C 構成，而東方 型 （ESS－type）H.pylori主要 由 EPIYA－A，－B 和－D 構成。西方型菌株約70%的H.pylori有cagA基因，而東亞地區如我國90%以上H.pylori含有cagA基因。東方型幽門螺桿菌比西方型幽門螺桿菌表現更顯著的細胞形態的改變和更嚴重的感染癥狀，進而，攜帶CagA蛋白越多的幽門螺桿菌比攜帶相對較少的CagA蛋白具有更強的毒性，并且與胃癌更密切相關［4，5］。正因為cagA的EPIYA重復機制與西方型和東方型CagA生物活性相關，也就能夠解釋不同地域因幽門螺桿菌感染而發展成胃癌的發病率的不同［6，7］。

我們前期研究結果顯示西方型幽門螺桿菌和東方型幽門螺桿菌感染細胞后［8，9］，CagA蛋白動態變化不同，細胞分泌IL－8動態變化不同，證明不同基因型的幽門螺桿菌感染細胞出現不同的感染結局，如胃癌、胃炎及胃潰瘍等，疾病發展結局與其感染幽門螺桿菌基因型相關。本文將繼續討論不同基因型H.pylori感染細胞后，IL－8mRNA動態表達水平是否與CagA蛋白相關，進而討論幽門螺桿菌的致病機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系和幽門螺桿菌

在37℃、5%CO2環境下，用含10%胎牛血清（Biochrom Ltd）的細胞培養液 RPMI 1640＋7（Nikken bio medical）培養AGS細胞（人胃癌上皮細胞，ATCC CRL1739c）。

試驗菌株野生型 H.pylori 26695（WSS－type CagA）和 HPK5（ESS－type CagA），每株野生型 H.pylori的cagA基因敲除株（cagA disrupted mutant strain）26695CA 和 HPK5CA［10］。菌株培養于含10%馬血清的布氏肉湯（BD）中，置于5%O2、10%CO2和85%N2混合氣體的微需氧培養箱中增菌培養。用600nm（OD600）分光光度計（GeneQuant，Biochrom Ltd）測定吸光度和菌落形成單位（colonyforming units（CFU））評估細菌生長狀態［11］。

1.2 cagA基因

模版DNA制備采用基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN）提取H.pylori DNA。取DNA 1μl為模版進行PCR擴增，引物為：cagA，5′－TGCATGCAGGAGAAACAATGACTAACG－3′（sense）和cagA，5′－TGCTTAATTAAGATTTTTGGAAACC－3′（antisense）。PCR擴增條件：96℃變性2min；95℃變性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸4min，40個循環；終止延伸72℃5min。PCR產物經0.7%瓊脂糖凝膠電泳，0.5mg／L溴化乙錠染色紫外線顯影。

1.3 H.pylori感染細胞試驗

將AGS細胞 （0.5×106）用RPMI1640＋7培養液培養在六孔培養板（Sumitomo Bakelite）培養兩天，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗兩次，按照細菌與細胞比例（multiplicity of infection，MOI）150，用RPMI 1640（Invitrogen）配制的菌液，感染細胞，同時以不加入細菌的AGS細胞作對照，置培養板于37℃微需氧條件培養，分別收集3小時、6小時、12小時、24小時和48小時的感染細胞，檢測IL－8mRNA。

1.4 同步感染試驗

用含10%胎牛血清的RPMI 1640＋7培養液培養AGS細胞于6孔培養板中，培養兩天，當單層細胞達到30% 細胞生長狀態（cell confluence）時，用PBS沖洗細胞，按照MOI 150將細菌加入培養板中，離心600xg，5min，將培養板置于溫箱孵育，在相應的時間收集標本。

1.5 RT－PCR

用RNA TRIzol試劑盒提取幽門螺桿菌感染細胞和未加幽門螺桿菌的對照AGS細胞（Invitrogen），按說明書操作。抽提RNA經過DNase（Promega）處理后，反轉錄酶PowerScriptTMReverse transcriptase（Clontech）合成cDNA。cDNA引物IL－8：5′ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC－3′（sense）和 IL－8 5′TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC3′（antisense）［12］。擴增條件：94℃變性1min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環；終止延伸72℃5min。核蛋白L7a為對照，L7a引 物： 5′－TTTGGCATTGGACAGGACATCC－3′（sense）和 5′－AGCGGGGCATTTCACAAAG－3′（antisense）［13］。L7aPCR 反 應 條 件：95℃ 變 性1min；94℃變性30sec，57℃退火20sec，72℃延伸1min，32個循環；終止延伸72℃5min。

2 結果

2.1 H.pylori誘導IL－8mRNA表達

為驗證幽門螺桿菌是否誘導IL－8mRNA產生，我們用野生型 H.pylori 26695和 HPK5以MOI 150：1感染AGS細胞，AGS細胞被H.pylori感染后顯示IL－8mRNA呈現時間依賴性（time－dependent）升高（圖1），即AGS被H.pylori 26695感染3小時后IL－8mRNA升高，持續升高直至感染48小時，結果提示幽門螺桿菌感染細胞后誘導細胞炎癥因子IL－8基因表達。對照未感染細菌的AGS細胞沒有IL－8mRNA表達。

2.2 不同野生型菌株產生IL－8mRNA不同

為驗證不同菌株H.pylori感染細胞后是否誘導IL－8產生不同的模式，我們用 WSS－type 26695和ESS－type HPK5感染 AGS，顯示IL－8mRNA呈現不同升高模式（圖1）。H.pylori HPK5時間依賴性（time－depedent）增加模式表現為感染3小時后升高，隨后降低，12小時再次出現峰值，隨后降低，在整個感染過程中均有IL－8mRNA表達。

2.3 cagA 基 因 突 變 株 （cagA－discrupted mutant strain）誘導IL－8mRNA表達

為驗證cagA基因突變是否影響IL－8mRNA表達，我們用cagA基因突變株H.pylori 26695CA和HPK5CA以 MOI 150：1感染AGS細胞，顯示AGS細胞被H.pylori cagA基因突變菌株感染后IL－8mRNA 呈現時間依賴性（time－dependent）升高，持續升高至48小時（圖1）。結果提示AGS細胞IL－8mRNA升高不僅受cagA基因影響，還有其他因素參與IL－8mRNA的表達調控。

2.4 不同cagA 基因突變株（cagA－discrupted mutant strain）誘導IL－8mRNA表達不同

突變株26695CA和HPK5CA感染細胞后IL－8 mRNA表達不同（圖1），26695CA感染3小時后升高，持續至48小時，峰值表現在6小時和12小時；而HPK5CA感染3小時后未升高，6小時迅速達峰值，隨后降低，48小時又出現峰值。結果提示不同cagA基因型菌株表達IL－8mRNA不同。

圖1 幽門螺桿菌感染AGS細胞IL－8mRNA的RT－PCR 2%瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

幽門螺桿菌慢性持續感染可導致胃粘膜產生白細胞介 素，雖 然 白 細 胞 介 素 （IL）－1B，IL－1RN 和TNF－A多態性與胃癌和胃潰瘍相關［14］，但是IL－8基因是否與胃疾病相關還不清楚。細菌感染細胞后，引 起 促 炎 細 胞 因 子 （pro－inflammatory cytokines）升高、抗炎細胞因子（anti－inflammatory cytokines）降低的H.pylori感染易引起胃癌和胃潰瘍發生，反之易導致胃粘膜反應。

在幽門螺桿菌感染細胞的過程中，cagA基因編碼的CagA蛋白運輸到胃上皮細胞，定位于細胞的漿膜面，CagA通過依賴或不依賴Src家族蛋白激酶發生酪氨酸磷酸化與多種細胞蛋白作用，調控細胞生長和運動相關的信號通路，使胃上皮細胞發生轉化而致癌變，引發一系列瀑布式級聯反應，激活一系列信號事件，細胞出現伸展、擴散及形態改變為特征的蜂鳥表型［15，16］。同時，誘導IL－8mRNA 時間依賴性表達，西方型菌株與東方型菌株感染細胞后表達IL－8mRNA模式不同；cagA基因突變株同樣可誘導IL－8mRNA表達且不同突變菌株IL－8mRNA模式不同；我們曾報導H.pylori感染AGS的IL－8動態分泌水平［8，9］，26695（峰值12小時）和 HPK5（峰值48小時）在感染細胞過程中IL－8持續升高；突變株雖然在感染早期IL－8表達低濃度，但是在48小時突變株與野生株無顯著差異，這些數據提示IL－8基因和其蛋白表達不僅與CagA蛋白相關，還與其他信號通路相關，如H.pylori的PI3K／Akt通過 NF－kB誘導IL－8 產生［17］。考慮到不同 H.pylori泳動速度不同，菌株感染接觸細胞的時間可能影響IL－8mRNA的早期表達水平，我們采用同步感染試驗，給予不同菌株相同外力，使細菌以相同速度感染細胞，探求IL－8表達水平，證明同步感染試驗與非同步感染試驗IL－8表達無差異。本文提示cagA基因是誘導細胞表達IL－8mRNA的重要因子，但并非是唯一因素，驗證幽門螺桿菌感染宿主致病機制的復雜性。幽門螺桿菌感染的臨床表現各異，大部分感染者終生無癥狀，出現不同感染結局的原因之一是：幽門螺桿菌在長期進化過程中，在不同人群和壓力等不同環境條件下為適應宿主生存環境形成了基因高度多態性，以利于獲得生存，在持續感染過程中繁殖，正是因為基因多態性導致菌株之間存在致病力的差異，在西方和東方人群H.pylori基因型分布不同能夠解釋導致胃疾病的不同發病率及結局。同時，幽門螺桿菌感染致病不是一種因素作用的結果，而是其多種因素整體作用及細菌與宿主細胞相互影響的綜合結局［18，19］。

菌株之間的毒力因子的基因差異不僅影響感染宿主導致疾病而且也影響炎癥和胃酸輸出。在感染宿主過程中，H.pylori可能會為適應宿主而發生突變、DNA置換產生新的基因型。本研究證明了幽門螺桿菌在感染宿主過程中誘導與感染相關的炎癥因子IL－8基因表達，如果采用降低或抑制IL－8表達，以求緩解幽門螺桿菌感染的臨床癥狀，作為評估藥物療效、解析幽門螺桿菌耐藥和根治失敗的問題、引導臨床選藥是未來值得探索的課題，如唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）通過酸化環境可抑制幽門螺桿菌感染細胞誘導產生IL－8的降低及減少CagA蛋白的釋放［20］，提示是否可用生物機制即益生菌（probiotic bacteria）控制幽門螺桿菌感染引起的炎癥反應。

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