米非司酮治療子宮肌瘤的療效相關(guān)因子研究

江 娜 丁盛娣 陳文兵 朱雪瓊

子宮肌瘤好發(fā)于生育年齡婦女，是最常見的盆腔良性腫瘤，也是導(dǎo)致子宮切除術(shù)的最常見原因。近年研究表明:孕激素在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著和雌激素同樣重要的作用［1］。孕激素可能是通過某些生長因子如:胰島素樣生長因子 －1(insulin－like growth factor－1，IGF－1)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor－β，TGF－β)等來發(fā)揮調(diào)控子宮肌瘤生長的作用［2］。

米非司酮是一種抗孕激素受體和弱的抗糖皮質(zhì)激素受體的甾體類藥物。臨床上米非司酮常被用于治療有癥狀的子宮肌瘤，但是米非司酮只對部分子宮肌瘤有效，而且存在停藥后反跳生長的現(xiàn)象，因此大多被用于術(shù)前縮小子宮肌瘤體積以糾正貧血和減少術(shù)中出血［3］。迄今為止，關(guān)于米非司酮治療子宮肌瘤療效相關(guān)因子的研究尚未見報道。本研究對照分析米非司酮治療子宮肌瘤組和未治療組、米非司酮治療有效組和治療無效組中IGF－1、TGF－β和肥大細胞的表達差異，以期尋找米非司酮治療子宮肌瘤療效相關(guān)的因子。

材料與方法

1．病人和標(biāo)本:2005～2009年在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的患者66例，均為絕經(jīng)前的婦女，臨床癥狀明顯，并經(jīng)過婦科檢查及B型超聲證實，符合子宮肌瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)。這些病人分成兩組，第1組包括34例病人(平均年齡為44．96±6．55歲)，經(jīng)米非司酮(浙江仙居制藥公司生產(chǎn)，12.5mg/25mg口服每天1次)治療后行肌瘤剝除術(shù)或子宮切除術(shù)，第2組包括32例病人(平均年齡為43．50±5．84歲)，直接行手術(shù)治療。第1組病人中，用藥前及用藥3個月后分別行盆腔及婦科檢查，用B超測量子宮肌瘤的三維徑線，按公式V=πabc/6(a、b、c分別代表肌瘤在三維的3個切面的直徑)的方法計算子宮肌瘤體積［4］。對于多發(fā)性子宮肌瘤者，計算最大子宮肌瘤的體積作為代表性結(jié)果。子宮肌瘤體積縮小≥20%為治療有效，子宮肌瘤體積縮小20%以下的為治療無效。得到有效組20例，無效組14例。

2．免疫組化染色:標(biāo)本用低溫生理鹽水去除血液和污漬，10%甲醛固定，蠟塊包埋，4μm連續(xù)切片。所有肌瘤標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)生確診為普通型子宮平滑肌瘤。使用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶法(streptavidin peroxidase)SP法。切片脫蠟入水，組織抗原微波修復(fù)，先中低火5min，停5min后再中低火3min;PBS 3min，3次;3%H2O2阻斷過氧化物酶活性10min;PBS 3min，3次;正常山羊血清室溫孵育10min;滴加一抗(IGF－1鼠抗人抗體1∶50稀釋，美國 Santa Cruz公司;TGF－β鼠抗人抗體1∶200稀釋，美國Santa Cruz公司;即用型肥大細胞類胰蛋白酶鼠抗人抗體，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，4℃過夜，PBS 5min，3次;生物素標(biāo)記二抗室溫孵育30min，PBS 3min，3次;DAB顯色，顯微鏡觀察，水洗終止;蘇木素復(fù)染，淡氨水返藍;樹脂封片，光鏡下觀察。每一批染色均設(shè)陰性和陽性對照。以PBS代替一抗做陰性對照，用已知有表達的乳腺癌切片作為陽性對照。

3．染色結(jié)果判斷:(1)IGF－1和TGF－β染色結(jié)果判斷:IGF－1和TGF－β的陽性表達黃色顆粒主要定位于細胞質(zhì)。每張切片觀察10個隨機400倍視野，每個視野觀察100個細胞，根據(jù)免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)分別進行陽性率及著色強度評分。I代表染色強度:無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分。P代表同一染色強度細胞所占計數(shù)細胞百分率:無著色為0分，＜25%為1分，25% ～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將陽性率和染色強度兩項評分的乘積進行統(tǒng)計學(xué)分析。(2)肥大細胞染色結(jié)果判斷:肥大細胞類胰蛋白酶胞質(zhì)著色。類胰蛋白酶陽性者胞質(zhì)呈黃棕色。肥大細胞計數(shù)采用隨機連續(xù)計數(shù)10個高倍視野(×400)的肥大細胞數(shù)，再計算每個高倍視野下肥大細胞平均數(shù)進行統(tǒng)計。

4．統(tǒng)計學(xué)方法:采用 SPSS 17．0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，IGF－1和TGF－β的表達為非正態(tài)分布資料，故數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(P25－P75)表示，兩組之間的比較采用Mann－Whitney U檢驗。肥大細胞數(shù)為正態(tài)分布，而且兩組之間方差齊性，故數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗。

結(jié) 果

1．IGF－1在米非司酮治療后手術(shù)組和直接手術(shù)組的表達比較，見圖1。在米非司酮治療后手術(shù)組中，IGF－1的表達為1(0～4)。在直接手術(shù)組中，IGF－1的表達為2(2～4)，經(jīng) Mann－Whitney U檢驗，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。米非司酮治療后手術(shù)組中IGF－1的表達明顯低于直接手術(shù)組。

圖1 IGF－1在直接手術(shù)子宮肌瘤患者中的表達(SP，×400)

2．IGF－1在米非司酮治療子宮肌瘤有效組和米非司酮治療子宮肌瘤無效組中的表達:米非司酮治療子宮肌瘤無效組IGF－1的表達為0(0～1)，米非司酮治療子宮肌瘤有效組IGF－1的表達為4(0．25～6．00)，經(jīng)Mann－Whitney U檢驗，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)。

3．TGF－β在米非司酮治療后手術(shù)組和直接治療組中的表達:在米非司酮治療后手術(shù)組，TGF－β的表達為4(2～6)。在直接手術(shù)組中，TGF－β表達為4(2～6)，經(jīng)Mann－Whitney U檢驗，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

4．米非司酮治療子宮肌瘤有效組和無效組中TGF－β的表達:米非司酮治療子宮肌瘤有效組TGF－β的表達為4(2．5～6．0)，米非司酮治療子宮肌瘤無效組TGF－β的表達為4(2．0～4．5)，經(jīng) Mann－Whitney U檢驗，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

5．肥大細胞在米非司酮治療后手術(shù)組和直接治療組中的表達，見圖2。肥大細胞在米非司酮治療后手術(shù)組中的計數(shù)為7．38±1．38/HPF，在直接手術(shù)組7．23 ±0．80/HPF，經(jīng) t檢驗，兩組間肥大細胞的表達無顯著性差異(P＞0．05)。

圖2 肥大細胞在子宮肌瘤中的表達(SP，×400)

6．米非司酮治療子宮肌瘤有效組和無效組中肥大細胞的表達:肥大細胞在米非司酮治療有效組中的計數(shù)為7．43±2．96/HPF，在米非司酮治療無效組中7．66 ±1．93/HPF，經(jīng) t檢驗，兩組間肥大細胞的表達無顯著性差異(P＞0．05)。

討 論

米非司酮的使用可以縮小子宮肌瘤體積，但只對部分患者有效，而且存在停藥后反跳生長的情況［3］，但分子機制未明。研究表明:卵巢分泌的雌孕激素通過子宮肌瘤局部生長因子的作用，比如IGF－1、TGF－β、肥大細胞等形成一個復(fù)雜的分子系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，通過上調(diào)細胞的增殖和下調(diào)細胞的凋亡來調(diào)控子宮肌瘤的生長。Konon等［5］研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞可能通過貯存于其中的類胰蛋白酶來促進子宮肌瘤周圍的血管生成。將肥大細胞制成懸液注入動物體內(nèi)，可以導(dǎo)致腫瘤生長加速;阻止肥大細胞脫顆粒或減少肥大細胞數(shù)目均能抑制腫瘤生長。肥大細胞釋放的血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)、成纖維生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子－β(TGF－β)具有調(diào)控血管生長的作用。TGF－β在促進子宮肌瘤生成的細胞外基質(zhì)的增殖中起了重要作用。IGF－1以促有絲分裂劑的作用促進子宮肌瘤的生長。在體外培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞中，IGF－1明顯增加子宮肌瘤細胞增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，抑制細胞的凋亡，從而促進子宮肌瘤細胞的生長［6］。研究發(fā)現(xiàn)，人類子宮肌瘤局部IGF－1及其受體濃度在mRNA及其蛋白水平均明顯高于周圍正常肌層細胞，且不受月經(jīng)周期的影響［7］。然而孕激素受體拮抗劑米非司酮治療子宮肌瘤的療效與這些生長因子的相關(guān)性國內(nèi)外均尚未見報道。

Nakayama等［8］研究發(fā)現(xiàn)，予 GnRH －a治療后的子宮肌瘤中IGF－1的表達較未治療組明顯降低。Yamada等［9］研究表明，孕激素對于子宮肌瘤有雙重的作用，一方面孕激素通過上調(diào)表皮生長因子和Bcl－2來促進肌瘤的生長，另一方面通過下調(diào)IGF－1來抑制子宮肌瘤生長。Wang等［10］采用體外細胞培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)一種新型的孕激素受體調(diào)節(jié)劑可以抑制子宮平滑肌細胞中IGF－1的表達，但是卻對正常子宮肌層細胞的IGF－1的表達無影響。本研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮用藥組子宮肌瘤中IGF－1的表達明顯低于未用藥組，而用藥后手術(shù)組和直接手術(shù)組中TGF－β、肥大細胞的表達無差異，表明米非司酮可以下調(diào)子宮肌瘤中IGF－1的表達。本研究還發(fā)現(xiàn)，米非司酮治療有效組TGF－β、肥大細胞的表達與治療無效組無差異，而米非司酮治療有效組IGF－1的表達與治療無效組有顯著性差異，表明米非司酮治療子宮肌瘤的療效與TGF－β、肥大細胞無關(guān)，而與IGF－1的表達相關(guān)，具體機制尚待進一步研究。

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